Protocol
Cette étude est conforme à l'Université nationale de Singapour Institutional Animal Care et utilisation Commission (protocole approuvé no. R15-0225).
1. Préparation chirurgicale du modèle animal
- Canules Navire
- Anesthésier un des rats mâles Sprague-Dawley (6 - 7 semaines) pesant (203 ± 20) g avec de la kétamine (37,5 mg / ml) et de xylazine (5 mg / ml) cocktail par voie intrapéritonéale (ip) par injection (2 ml / kg) . Ne pas récapituler l'aiguille ou le retirer de la seringue après l'injection.
- Une fois que l'animal a été anesthésié (confirmé par orteil pincement), placez-le sur un coussin chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37 ° C. raser délicatement les cheveux sur les omoplates, col antérieure, le bas-ventre, jambe arrière médial et scrotum. retenir doucement les jambes à l'aide de bandes de papier adhésif.
- Effectuer toutes les interventions chirurgicales en utilisant des ciseaux de microdissection et des pinces inclinées lors de la visualisation par le biaisun stéréomicroscope. Placez tous les outils chirurgicaux pointus sur un plateau résistant à la perforation pour éviter les blessures pendant la chirurgie.
- Frotter tous les sites chirurgicaux 3 fois avec une alternance d'iode et 70% d'alcool avant d'effectuer l'incision. Rincer tous les cathéters avec 30 UI / ml solution d'héparine-solution saline.
- Faire 1 - 1,5 cm incision cutanée médiane sur les omoplates en utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux sur la veine jugulaire droite. Séparer le fascia par dissection pour exposer la veine jugulaire et Cathétériser avec un tube en polyéthylène (PE-50) rempli avec de l'héparine-solution saline en utilisant 5-0 sutures de soie. Perfuser anesthésie supplémentaire lorsque cela est nécessaire (1/3 à 1/2 de la dose initiale par voie intraveineuse (iv)) pendant toute la durée de la chirurgie et l'expérimentation.
- Effectuer trachéotomie pour maintenir la perméabilité des voies aériennes. Faire 1 - incision cm 1,5 dans la région cervicale antérieure. Cathétériser la trachée en utilisant un tube de polyethylene (PE-205) avec des sutures en soie 2-0 pour fixer le cathéter en place.
- Surveiller la pression artériellepar canulation dans l'artère fémorale. Faire 1 - incision cm 1,5 à la surface interne gauche de la patte arrière. Séparer l'artère fémorale par dissection. Cathétériser l'artère fémorale par un tube en polyéthylène (PE-10) rempli d'héparine-solution saline en utilisant des sutures en soie 5-0.
- Cremaster Muscle Préparation and Flow Visualization
- Insérez une suture 5-0 en soie à travers le sommet du scrotum de l'étendre. Faire une incision le long de la surface ventrale du scrotum. Appliquez régulièrement solution chaude isotonique (37 ° C; pH 7,4) au muscle exposé.
- Retirer entourant les tissus conjonctifs soigneusement et minutieusement à l'aide d'un coton-tige.
- Insérer un fil de suture en soie 5-0 à travers le sommet du muscle crémaster. Couper le fil de suture en deux morceaux de longueur égale et un nœud de chaque côté. Couper les muscles entre les deux noeuds et l'étirer sur une plate-forme de plexiglas transparent personnalisé en tirant doucement le fil de suture. Réparerl'extrémité de la suture sur la plate-forme avec tack bleu.
REMARQUE: la suppression approfondie des tissus environnants conjonctifs est crucial dans l'obtention optimale contraste de l'image. - 1.2.3 Répétez l'étape jusqu'à ce que 5 à 6 fixations sont faites. Retirez délicatement le muscle crémaster de l'épididyme en utilisant haute cautérisation de température. Superfuse solution chaude isotonique du muscle exposé pour prévenir la déshydratation du tissu.
- Entourez le muscle crémaster avec des pièces jointes de gaze. Couvrir le muscle exposée avec un film de polyvinyle. Les morceaux de gaze avec le film forment un bassin peu profond pour contenir une solution isotonique chaude pour l'objectif immersion dans l' eau microscope (figure 1A).
- Transférer l'animal sur la scène des animaux d'un microscope intravitale (figure 1C). Branchez le cathétérisme artériel à un système d'acquisition de données physiologiques pour la surveillance continue de la pression (figure 1E).
- Maintenir le temperat musculaireure à 35 ° C , avec un élément chauffant attaché en dessous de la plate - forme d'animaux (figure 1B). Placer une sonde de température côté du muscle pour fournir une rétroaction négative au régulateur de puissance de l'élément chauffant (Figure 1D).
- Laissez l'animal sur la scène pendant 15 min à équilibrer avec l'environnement.
- Visualiser le flux sanguin sous un microscope intravitale avec un objectif immersion dans l'eau 40X et d'un condenseur à travailler longtemps.
- Choisissez une artériole non ramifiées (<60 pm) sur la base d'un foyer image claire et contraste entre le noyau RBC, la LCF et des parois du récipient, afin de se concentrer le microscope sur le plan diamétral du vaisseau sanguin. Faire tourner la caméra montée sur le microscope pour aligner la paroi de la cuve verticale.
- Enregistrez le flux de sang à l'aide d'une caméra vidéo à haute vitesse à une cadence de 3.000 / s pendant 1 sec. Enregistrer la vidéo enregistrée comme non compressé format AVI en niveaux de gris de 8 bits pour préserver la qualité de l'image.
REMARQUE: Un taux minimum d'images d'enregistrement de 3000 images / sec est recommandé de veiller à ce que la mesure de la LCF peut être effectuée au moins une fois par RBC dans des conditions d'écoulement des artérioles physiologiques. - Utilisez un filtre bleu avec transmission de pic à une longueur d'onde de 394 nm et passe-bande spectrale à 310 - 510 nm pour améliorer le contraste entre les globules rouges et le plasma.
REMARQUE: Assurez-vous que le spectre de la lumière passant à travers le filtre bleu de la source de lumière microscopique (lampe halogène 100 W) est de faible intensité de la lumière pour éviter tout dommage tissulaire potentiel. - A la fin de l'expérience, l'animal euthanasie par surdose de pentobarbital sodique.
2. Analyse de l' image
- Prétraiter pour la mesure de la largeur de la LCF
- Ouvrez MATLAB et exécutez le fichier 'CFL_pre.m'. (Ceci et d'autres fichiers MATLAB peut être trouvé dans leip "> Supplemental MATLAB Archive.)
- Cliquez sur "Ouvrir le fichier" pour sélectionner le fichier vidéo à analyser.
- Réglez la glissière de la 'Rotation' pour aligner les parois des vaisseaux verticalement.
REMARQUE: Les utilisateurs peuvent afficher les lignes de la grille aidant à l'alignement du navire en sélectionnant le bouton radio 'Grid On', et d'ajuster le niveau de l'image de zoom en faisant glisser le curseur 'Zoom'. - Cliquez sur le bouton 'Confirmer Edition' pour confirmer l'alignement des navires.
- Cliquez sur le bouton «Set ROI à la culture» pour définir la région d'intérêt (ROI). L'image aligné sera affiché dans une fenêtre pop-up. Ajustez l'objectif rectangulaire sur l'image, et double cliquer pour confirmer le retour sur investissement. Passer cette étape si le recadrage de l'image ne soit pas nécessaire.
NOTE: Inclure seulement un navire dans le retour sur investissement pour analyser la largeur de la LCF du navire. Cliquez sur le bouton «Rétablir l'image" pour restaurer l'image à sa forme originale, le cas échéant. - Clique le9; Extrait de bouton pour extraire toutes les images vidéo éditées en consécutifs d'images en niveaux de gris (8 bits 'Images format bmp'). Les images extraites peuvent être trouvées dans le dossier avec le même nom que le fichier vidéo sélectionné.
- Mesure de la largeur de la LCF
- Ouvrez MATLAB et exécutez le fichier 'CFL_measure.m'.
- Cliquez sur "Sélectionner un dossier" pour sélectionner le dossier contenant les images extraites.
- Cliquez sur le dossier contenant les images et cliquez sur "Sélectionner un dossier". La première image dans le dossier sera chargé et affiché dans la «image Grayscale 'écran, ainsi que son histogramme d'intensité de gris dans le panneau' image Histogramme '.
- Sélectionnez le cadre de l'image souhaitée dans la zone de liste pour effectuer l'analyse, sinon la première image sera sélectionnée.
- Cliquez sur "Trouver les parois des vaisseaux» pour identifier la paroi intérieure du vaisseau dans l'image, qui est déterminée à l'endroit où lelumière profil d'intensité de pointe transits de l'obscurité à la lumière sur deux pixels.
- Cochez «Filtre médian» pour appliquer un filtre médian à l'image pour réduire le bruit «poivre et sel».
- Vérifiez 'Contraste automatique' pour ajuster les intensités de l'image numérique pour améliorer le contraste de l'image.
- Sélectionnez un algorithme de seuillage dans la zone de liste qui détermine automatiquement une valeur de seuil (de τ) qui divise les niveaux de gris en deux classes - pixels blancs avec des niveaux de gris ci-dessus τ (CFL), et les pixels noirs avec des niveaux de gris ci-dessous τ (de base RBC).
NOTE: Comme une méthode alternative, utiliser seuillage manuel si aucun algorithme automatisé-seuillage fournit une image seuillage appropriée. Cliquez sur le bouton «Manuel» de la radio et réglez le curseur pour définir la valeur manuelle de seuillage. - Pour mesurer la variation spatiale des largeurs de la LCF, entrez la résolution en pixels dans la case «Pixel Résolution» (la résolutionavec cette configuration expérimentale était de 0,42 um / pixel).
- Cliquez sur le bouton «Calculer» pour obtenir la variation spatiale des largeurs de la LCF. Cliquez sur '.csv Exporter' pour exporter les données de largeur de la LCF dans un format sous forme de tableaux.
- Pour mesurer la variation temporelle des largeurs de la LCF à une ligne d'analyse spécifique le long du navire, cliquez sur le bouton radio «variation temporelle» et entrez les informations de fréquence d'images (le taux de trame utilisé dans ce dispositif expérimental était de 3000 images / s).
- Saisissez la première image et la dernière image des images pour l'analyse dans les cases «Démarrer Frame 'et' Last Frame ', respectivement.
- Sélectionnez la position de la ligne d'analyse le long du vaisseau en faisant glisser la barre de glissement du 'analyse Line'. Vérifiez la position de la ligne d'analyse, qui est illustrée à la fois «l'image en niveaux de gris" et "l'image binaire.
- Cliquez sur «Calculer» pour obtenir la variation temporelle des largeurs de la LCF. Click 'Export .csv' pour exporter les données de largeur de la LCF dans un format sous forme de tableaux.
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Representative Results
La visualisation de la LCF in vivo est largement tributaire de la préparation chirurgicale de l'animal. la perte de sang excessive ou de la durée de la chirurgie prolongée peuvent soumettre l'animal aux chocs et aux aberrations de la circulation sanguine. Maintien de la température des tissus en utilisant un coussin chauffant, ainsi qu'une plate-forme personnalisée pendant la chirurgie et l'expérience est également cruciale pour le maintien des conditions physiologiques du rat. En utilisant une lampe halogène de 100 W dans le système de microscope, aucun dommage tissulaire visible n'a été observée même à la fin de l'expérience.
La figure 2A montre un flux typique de RBC par une artériole non ramifié dans le crémaster chez le rat, où la CLF peut être observée entre le noyau RBC et la paroi interne du vaisseau (figure 2C). Un bon contraste entre ces composants pendant l'expérience est essentielle pour assurer la précision de la largeur de la LCF mesures. La phase initiale de l'analyse d'image comprend lala détection de la paroi interne du vaisseau. En acquérant le profil d'intensité lumineuse le long de la ligne d'analyse perpendiculaire à la cuve, l'emplacement est approchée au sommet que les transits de l' obscurité à la lumière sur deux pixels (figure 2B).
Comme hématies et CFL possèdent différentes de transmission de lumière, la différence de niveaux de gris peut être subdivisé en deux classes (image binaire). Toutefois, l'identification d'une valeur de seuil précis entre les deux pics dans l'histogramme de l' image peut être limitée par la mauvaise qualité de l' image et de contraste (figure 3A). Pour améliorer le contraste entre les hématies et CFL, un filtre bleu peut être utilisé (figure 3B). Cela se manifeste également dans la figure 4, dans laquelle les limites du noyau RBC peuvent être identifiées de façon plus précise à l'aide d'un filtre bleu. En outre, la sélection de l' algorithme de seuillage 20-23 peut également influencer la mesure de la largeur DFC (figure4). Il est évident à la figure 4A que les différents algorithmes de seuillage ont donné lieu à différentes limites de base RBC identifié, qui pourrait à son tour conduire à des mesures erronées de la LCF. Pour mieux illustrer l'influence de l'algorithme de seuillage sur la mesure de la largeur de la LCF sur la figure 4B, les profils spatiaux pour les largeurs de DFC obtenues en utilisant différents algorithmes de seuillage sont représentés sur la figure 5 et sont résumés dans le tableau 1.
Figure 1:. Intravitale Système microscopique et Cremaster Muscle Préparation A:. Chirurgicalement extériorisé muscle crémaster rat B: Customized plate - forme avec des éléments de chauffage pour placer le muscle crémaster et maintenir sa température à 35 ° C C:. Système microscopique avec cuspersonneue stade animal et la caméra à haute vitesse pour la visualisation des flux de sang de la microcirculation dans le crémaster muscle D:. régulateur de température de rétroaction négative et l' alimentation E:. Physiological système d'acquisition de données pour la surveillance continue de la pression. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Traitement de l' image pour la détermination du navire mur Position et CFL Largeur A:.. L' image typique de niveaux de gris de l' écoulement RBC dans une artériole (diamètre du vaisseau = 52 um) B: profil d'intensité lumineuse le long de la ligne d'analyse (en trait plein dans le panneau A) . C: résultat représentatif de la mesure de la LCF le long du navire. leflèches pleines et pointillées indiquent la paroi du récipient interne et le bord externe du noyau de RBC, respectivement. (LWB & RWB: gauche et mur navire limite droite, LCB & RCB: gauche et droite RBC limite de base) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:.. Contraste de l' image mise en valeur avec un filtre bleu image optique de l' histogramme des images en niveaux de gris obtenus sans (A) et avec filtre bleu (B) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: RBC Largeur de base déterminée en utilisant cinq différents algorithmes de seuillage limites de RBC noyau et la paroi du vaisseau en surimpression sur les images en niveaux de gris dans la figure 3.. (Haut de la ligne (A): sans filtre bleu, rangée du bas (B): avec filtre bleu) en utilisant (de gauche à droite) la méthode de l'Otsu, la méthode minimum, la méthode intermodes, méthode de sélection itérative (Isodata) et seuillage entropique floue (Shanbhag). Les lignes pleines et pointillées indiquent la paroi intérieure du vaisseau et le bord externe du noyau RBC, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Variation spatiale des CFL Largeur des largeurs CFL correspondant à la figure 4B le long de la gauche (A).et à droite (B) les parois des vaisseaux, respectivement. (D: distance du diamètre du récipient) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1: Valeurs de seuil et CFL Largeur des données sur la figure 5. * p <0,001: différence significative par la méthode de Otsu. † p <0,001: différence significative par rapport à gauche. Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant des tests t non appariés à deux queues.
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Discussion
La mesure de la largeur de la LCF est essentielle pour une meilleure compréhension de l'hémodynamique dans la microcirculation. En particulier, la mesure des largeurs de la LCF a été réalisée en mésentérique 6, spinotrapezius 24 et 25 cérébraux microcirculations. Mesure conventionnelle des largeurs in vivo de la LCF a été limitée aux estimations par une inspection manuelle des images vidéo enregistrées. Les mesures manuelles nécessaires à la moyenne de plusieurs trames vidéo successives avant d' identifier visuellement les limites du noyau et des parois du récipient RBC 15,16. Dans une autre étude, l' isothiocyanate de fluorescéine (FITC) marqués à hématies et rhodamine B isothiocyanate (RMCT) plasma marqué ont été utilisés pour déterminer les largeurs CFL moyennes de chat microvaisseaux cérébraux 25. Ces méthodes de mesure précédentes prennent beaucoup de temps et nécessitent des étapes supplémentaires pour le marquage fluorescent, ce qui limite la résolution spatiale et temporelle du wi CFLmesure dth. En revanche, en couplant les enregistrements de la caméra à grande vitesse à une segmentation d'image efficace et l'analyse, la technique démontrée ici permet la quantification des variations spatio-temporelles de la LCF avec une résolution spatiale (0,42 um) d'un ordre inférieur à la taille d'un RBC et une résolution temporelle de 1/3000 s.
préparation chirurgicale correcte du muscle crémaster est essentielle pour déterminer la précision de la largeur des mesures de la LCF. En particulier, l'élimination complète des tissus conjonctifs adjacents est essentielle pour assurer une bonne mise au point des artérioles du muscle crémaster. En outre, la résolution temporelle et spatiale de la mesure est fonction du microscope et de la caméra spécifications. Alors que l'objectif d'agrandissement supérieur peut améliorer la résolution spatiale, il réduit le champ de vision, ce qui limite la longueur de la cuve pouvant être obtenu pour quantifier la variation spatiale de la largeur de la LCF. Par conséquent, le microscopiconfigurations c peuvent être modifiés en fonction de l'application spécifique de la technique.
La segmentation d'images est un autre facteur important pour la précision de la mesure de la largeur de la LCF. Parmi les différentes techniques développées, l'image seuillage en fonction du niveau de gris histogramme fournit une approche simple et efficace pour la segmentation d'images et d'analyse. Par conséquent, les objets d'avant-plan sont extraites de l'arrière-plan sur la base de la différence des niveaux de gris. Dans le cas idéal, l'histogramme de l'image sera bimodale et une valeur de seuil au fond de la vallée est trivial. Cependant, in vivo des images expérimentales ne présentent pas toujours de tels profils de niveau d' échelle de gris. Nos résultats ont montré comment la qualité d'image et de contraste peuvent influencer le processus de segmentation d'image. L'utilisation d'un filtre bleu optique considérablement amélioré le contraste entre les globules rouges et le plasma dans une artériole (Figure 3), et il semble être essentielle lorsque applying seuillage d' histogramme en fonction de la mesure de la largeur de la LCF indépendamment des algorithmes (figure 4). Il en résulte un histogramme de l'image distincte bimodale, ce qui permet d'identifier la valeur de seuil efficace. Toutefois, il convient de noter que , même avec un histogramme bimodal obtenu à partir des images in vivo, une variation très inégale des deux pics (maxima local) et une large vallée (minimum local) de l'histogramme peuvent toujours influencer la sélection de seuil (tableau 1 ). Par conséquent, la sélection d'un algorithme de seuillage appropriée doit être examinée en fonction de la qualité d'image et les utilisateurs doivent tenir compte des limites de chaque algorithme de seuillage pour la meilleure aptitude à la quantification des largeurs de la LCF.
Étant donné que les largeurs de la LCF sont largement dépendantes des conditions d'écoulement, artérielle continue une mesure de pression pendant toute la durée de l'expérience est essentielle. Afin de déterminer les conditions d'écoulement locales,le débit du flux sanguin pseudoshear peut être calculée en mesurant la vitesse moyenne d'écoulement dans le vaisseau sanguin 5.
En résumé, les protocoles pour la préparation chirurgicale d'un muscle crémaster de rat et l' analyse d'image quantitative décrite ici ont été utilisées pour obtenir des informations quantitatives sur la variation dynamique de la largeur de la LCF in vivo. Les principaux défis pour assurer la précision des mesures de largeur de la LCF comprennent la préparation chirurgicale appropriée du muscle et de la segmentation d'images, qui ont tous deux été abordées ci-dessus. Cette technique peut être facilement adaptée à d'autres études microcirculation pour enquêter sur la hémorhéologique et les aberrations hémodynamiques dans diverses conditions physiologiques et pathologiques. Par conséquent, ces résultats contribuent à l'évolution future des approches thérapeutiques microvasculaires et l'intervention clinique.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intravital microscope | Olympus | BX51WI | Equipment |
| High speed camera | Photron | 1024PCI | Equipment |
| Blue filter | HOYA | B390 | Equipment |
| Pressure sensor & biopac system | Biopac system | TSD104A, MP100 | Equipment |
| Temperature controller | Shimaden | SR 1 | Equipment |
| Plasma Lyte A | Baxter | NDC:0338-0221 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Saline 0.9% | Braun | ||
| Heparin (5,000 IU/ml) | LEO | ||
| PE-10 polyethylene tube | Becton Dickinson | 427400 | .024" OD x .011" ID |
| PE-50 polyethene tube | Becton Dickinson | 427411 | .038" OD x .023" ID |
| PE-205 polyethene tube | Becton Dickinson | 427446 | .082" OD x .062" ID |
| 2-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 113-S | |
| 5-0 non-absorbable silk suture | Deknatel | 106-S | |
| Water circulating heating pad | Gaymar | ||
| Water bath | Fisher Scientific | Isotemp 205 | Equipment |
| Sterile Cotton Gauze | Fisher Scientific | 22-415-468 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-124 | |
| Dumont Forceps | Kent Scientific | INS14188 | Surgical instrument |
| Micro Dissecting forceps | Kent Scientific | INS15915 | Surgical instrument |
| Iris forceps 1 x 2 teeth | Kent Scientific | INS15917 | Surgical instrument |
| Vessel cannulation forceps | Kent Scientific | INS500377 | Surgical instrument |
| Micro scissor | Kent Scientific | INS14177 | Surgical instrument |
| Iris scissor | Kent Scientific | INS14225 | Surgical instrument |
| Vessel clip | Kent Scientific | INS14120 | Surgical instrument |
| Gemini cautery system | Braintree Scientific | GEM 5917 | Surgical instrument |
References
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