Bepaling van de Zeta Potentiële via nanodeeltjes Translocation Snelheden door een Tunable Nanopore: Met behulp van DNA-gemodificeerde deeltjes als een voorbeeld

Summary

Hier gebruiken we een polyurethaan afstembare nanopore geïntegreerd in een weerstandsbelasting puls detectie techniek nanodeeltjes oppervlaktechemie gekenmerkt via de meting van het translocatie snelheden, die kunnen worden gebruikt om het zeta potentieel van individuele nanodeeltjes bepalen.

Abstract

Nanopore technologieën, gezamenlijk bekend als resistieve pulssensoren (RPS), worden gebruikt voor het detecteren, kwantificeren en karakteriseren van eiwitten, moleculen en nanodeeltjes. Afstembare resistieve pulse sensing (TRPS) is een relatief recente aanpassing RPT dat een afstembare porie die kunnen worden gewijzigd in real time opgenomen. We gebruiken hier TRPS de translocatie tijden van DNA-gemodificeerde nanodeeltjes bewaken zijn bij het doorkruisen de afstembare porie membraan als functie van de DNA-concentratie en de structuur (dat wil zeggen enkelstrengs aan dubbelstrengs DNA).

TRPS is gebaseerd op twee Ag / AgCl-elektroden gescheiden door een elastomeer membraan porie dat een stabiele ionenstroom op een aangelegd elektrisch veld bepaalt. In tegenstelling tot diverse optische gebaseerde deeltjes karakterisering technologieën, kunnen TRPS individuele deeltjes te karakteriseren onder een steekproef bevolking, waardoor voor multimodaal monsters worden geanalyseerd met gemak. Hier tonen we zetapotentiaal metingendeeltje via translocatie snelheden van bekende standaarden en toepassen op analyt translocatie maal monster, hetgeen resulteert in de meting van de zeta-potentiaal van deze analyten.

Te verschaffen, om gemiddelde zeta potentiaal waarden worden de monsters allemaal gemeten onder toepassing van een deeltje per deeltje perspectief vertoont meer informatie over een bepaald monster door monster populatieverdelingen bijvoorbeeld. Van een dergelijke, deze methode toont potentieel binnen sensing toepassingen zowel medische en milieugebied voor.

Introduction

Gefunctionaliseerde nanodeeltjes worden steeds populairder als biosensoren zowel medische en milieu velden. Het vermogen om een nanodeeltje de oppervlaktechemie te veranderen, met DNA, bijvoorbeeld, is nuttig voor gerichte geneesmiddelafgiftesystemen ¹ en controle DNA-eiwit interacties ^2-4 blijkt. Een steeds vaker voorkomende nanodeeltjes pand wordt gebruikt in bioassays en in de levering van geneesmiddelen is superparamagnetisme ^5. Superparamagnetische deeltjes (POD) zijn zeer bruikbaar bij het identificeren en verwijderen van specifieke analyten uit complexe mengsels en kan dit met de eenvoudige bediening van een enkele magneet. De verwijderde de analyt gebonden deeltjes kunnen worden gekarakteriseerd en geanalyseerd geschikt voor het doel.

Vorige methoden voor de detectie en karakterisering van nanodeeltjes omvatten optische technieken zoals dynamische lichtverstrooiing (DLS), alias fotoncorrelatiespectroscopie. Hoewel een high throughput techniek DLS beperkt tot zijnde een gemiddelde gebaseerde techniek en bij de analyse van multimodale monsters zonder toevoeging van gespecialiseerde software, zal de grotere deeltjes een meer dominante signaal te produceren, waardoor sommige van de kleinere deeltjes volledig onopgemerkt ^6,7. Particle-by-deeltjes karakterisering technieken zijn daarom veel gunstiger voor nanodeeltjes en gefunctionaliseerde nanodeeltjes te analyseren.

RPS gebaseerde technologieën zijn gebaseerd op het aanleggen van een elektrisch veld aan een monster en controle op de transportmechanisme van de deeltjes door een synthetisch of biologisch nanopore. Een relatief recente nanodeeltjes detectie en typering techniek op basis van RPS is instelbaar resistieve pulse sensing (TRPS) ^8-16. TRPS Twee-elektrodensysteem gescheiden door een elastomeer, afstembare membraan poriën. Afstembaar porie werkwijze maakt analyten verschillende vorm ¹⁷ en afmetingen te meten via de transpoort mechanismen door de porie. Afstembare poriën zijn eerder gebruikt voor de detectie van kleine deeltjes (70-95 nm diameter) produceren vergelijkbare resultaten met andere technieken zoals transmissie elektronen spectroscopie (TEM) ^10. Wanneer een elektrisch veld wordt toegepast, wordt een ionenstroom waargenomen en als deeltjes / moleculen door de poriën passeren, zij tijdelijk de poriën blokkeren, waardoor een verlaging van de stroom die kan worden gedefinieerd als een "blokkade event. Elke blokkade gebeurtenis representeert een enkel deeltje zodat elk deeltje in een monster afzonderlijk kenmerk kan worden gebaseerd op de blokkade magnitude, Δ En volle breedte half maximum, FWHM, evenals andere eigenschappen blokkade. Het analyseren van individuele deeltjes als ze door een nanogaatje passeren is voordelig voor multimodaal monsters als TRPS succesvol en effectief een bereik kan onderscheiden van deeltjesgrootte AmonGST een enkel monster. Tunable resistieve pulse sensing voltooit maat ^10, zetapotentiaal ^12,18 en concentratie ¹⁵ metingen tegelijk in een enkele run en kan dus nog differentiëren monsters van soortgelijke, zo niet dezelfde grootte van hun oppervlakte lading ^19; een voordeel ten opzichte van alternatieve dimensionering technieken.

Zeta potentieel wordt gedefinieerd als de elektrostatische potentiaal op het vlak van afschuiving ^20, en wordt berekend uit deeltjessnelheden mocht steken een porie ^19. Zeta potentiaal metingen van afzonderlijke geeft dus inzicht in de mechanismen translocatie en het gedrag van nanodeeltjes systemen in oplossing waardevolle informatie voor de toekomst van nanodeeltjes test ontwerpen voor verschillende toepassingen. Deeltje per deeltje analyse van dergelijke aard maakt ook de verspreiding en verspreiding van zeta potentiaal waarden bij een steekproef worden onderzocht, waardoor meer informatie on reactiekinetiek (enkelstrengs aan dubbelstrengs DNA, bijvoorbeeld) en deeltjes stabiliteiten in oplossing te bereiken.

We beschrijven een techniek die detecteert en kenmerkend zowel ongemodificeerde en gemodificeerde DNA-SPP oppervlakken. De hierin beschreven protocol is toepasbaar op een reeks van anorganische en biologische nanodeeltjes, maar we tonen de procedure via DNA-gemodificeerde oppervlakken vanwege hun breed toepassingsgebied. De techniek kan de gebruiker onderscheid tussen enkelstrengs en dubbelstrengs DNA doelen op een nanodeeltje oppervlak, gebaseerd op deeltjes translocatie snelheden door een poriënsysteem en zo hun zeta potentieel.

Protocol

1. Het maken van de fosfaat gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (PBST) Buffer Ontbinden één tablet PBS (0,01 M fosfaatbuffer, 0,0027 M kaliumchloride, 0,137 M natriumchloride, pH 7,4) in 200 ml gedeïoniseerd water (18,2 MQ cm). Voeg 100 ul (0,05 (v / v)%) Tween-20 aan de 200 ml bufferoplossing als surfactant. 2. De voorbereiding van de Carboxyl polystyreen Particle Standards Vortex de kalibratie deeltjes gedurende 30 seconden voordat sonicatie gedur…

Representative Results

Figuur 1. Schematische weergave van het proces van zuivering en een magnetische TRPS meting. A) Voorbeeld van magnetische zuivering van het monster te beginnen met een monster dat teveel, ongebonden vangprobe DNA. B) TRP meet bijvoorbeeld i) Deeltjes die door de nanogaatje en ii) Blockade event geproduceerd uit deeltjes tijdelijk occlusie ionen in de porie veroorzaak…

Discussion

De berekening van de zeta potentiaal gebruikt kalibratie gebaseerde methode gerelateerd werk door Arjmandi et al. ^21. De duur van de translocatie deeltjes zijn bij het doorkruisen een nanopore wordt gemeten als een functie van aangelegde spanning, met een gemiddelde elektrisch veld en deeltjessnelheden op het geheel van een regelmatige conische porie. De elektroforetische mobiliteit is de afgeleide van 1 / T (waarin T de duur blokkade) ten opzichte van spanning, vermenigvuldigd met het kwadraat…

Materials

Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary – 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding – 5'GTAGTGAGGT3', End binding – 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging – 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V