Determinación del Potencial Zeta a través de nanopartículas de translocación velocidades a través de un sintonizable nanoporos: El uso de partículas de ADN modificado como ejemplo

Summary

Aquí se utiliza un nanopore sintonizable de poliuretano integrado en una técnica de detección de impulsos resistiva para caracterizar las nanopartículas química de la superficie a través de la medición de las velocidades de translocación de partículas, que se puede utilizar para determinar el potencial zeta de las nanopartículas individuales.

Abstract

tecnologías de nanoporos, conocidos colectivamente como sensores de pulso resistivas (RPS), están siendo utilizados para detectar, cuantificar y caracterizar las proteínas, las moléculas y nanopartículas. detección de pulso resistiva sintonizable (TRPS) es una adaptación relativamente reciente al PRC que incorpora un poro ajustable que puede ser alterado en tiempo real. Aquí, nosotros usamos TRPS para controlar los tiempos de translocación de las nanopartículas de ADN modificado a medida que atraviesan la membrana de poro sintonizable como una función de la concentración de ADN y la estructura (es decir, de una sola cadena en ADN de doble cadena).

TRPS se basa en dos electrodos de Ag / AgCl, separadas por una membrana de poro de elastómero que establece una corriente iónica estable a un campo eléctrico aplicado. A diferencia de las diversas tecnologías de caracterización de partículas basado en la óptica, TRPS pueden caracterizar partículas individuales en una población de la muestra, lo que permite muestras multimodales para ser analizados con facilidad. Aquí, demostramos medidas de potencial zetaa través de las velocidades de translocación de partículas de estándares conocidos y aplicar estos a la muestra tiempos de translocación de analito, lo que resulta en la medición del potencial zeta de los analitos.

Así como la adquisición de valores del potencial zeta medias, las muestras se miden utilizando una perspectiva de partícula por partícula que exhibe más información sobre una muestra dada por medio de distribuciones de la población de la muestra, por ejemplo. De tal, este método demuestra potencial dentro de aplicaciones de detección para ambos campos de la medicina y ambientales.

Introduction

nanopartículas funcionalizadas se están convirtiendo cada vez más popular como biosensores en ambos campos de la medicina y ambientales. La capacidad de alterar la química de la superficie de una nanopartícula, con el ADN, por ejemplo, está demostrando útil para sistemas de administración de fármacos dirigidos ¹ y monitoreo interacciones ADN-proteína ^2-4. Una propiedad de nanopartículas cada vez más común siendo utilizado en los bioensayos y en la entrega de la terapéutica es superparamagnetismo ^5. partículas superparamagnéticas (SPP) son extremadamente útiles en la identificación y eliminación de sustancias específicas de análisis a partir de mezclas complejas y pueden hacerlo con el simple uso de un solo imán. Una vez extraídas, las partículas de analito unido se pueden caracterizar y analizar adecuado para el propósito.

Los métodos anteriores utilizados para la detección y caracterización de nanopartículas incluyen técnicas ópticas tales como la dispersión dinámica de luz (DLS), también conocida como espectroscopía de correlación de fotones. Aunque un hitécnica de rendimiento gh, DLS se limita a ser una técnica basada promediado y en el análisis de muestras multimodales sin la adición de un software especializado, las partículas más grandes producirán una señal mucho más dominante, dejando algunos de las partículas más pequeñas totalmente desapercibido ^6,7. Partícula por partícula técnicas de caracterización, por tanto, son mucho más favorables para analizar los sistemas de nanopartículas funcionalizadas de nanopartículas y.

tecnologías basadas RPS se basan en la aplicación de un campo eléctrico a una muestra y el seguimiento del mecanismo de transporte de las partículas a través de un nanopore sintético o biológico. Una técnica de detección y caracterización de nanopartículas relativamente reciente basado en RPS es la detección de pulso resistiva sintonizable (TRPS) ^8-16. TRPS es un sistema de dos electrodos separados por una membrana de poros elastomérico, sintonizable. Un método sintonizable de poros permite analitos de una gama de ¹⁷ forma y tamaño para ser medido a través de su transmecanismos de puerto a través del poro. Poros sintonizables anteriormente se han utilizado para la detección de partículas pequeñas (70 a 95 nm de diámetro) que produce resultados comparables a otras técnicas como la espectroscopía electrónica de transmisión (TEM) ^10. Cuando se aplica un campo eléctrico, se observa una corriente iónica y como partículas / moléculas pasan a través del poro, que bloquean temporalmente el poro, causando una reducción en la corriente que se puede definir como un "evento bloqueo '. Cada evento bloqueo es representante de una sola partícula de manera que cada partícula dentro de una muestra se pueden caracterizar individualmente basa en la magnitud bloqueo, Δ , Y la anchura total media-máxima, FWHM, así como otras propiedades del bloqueo. El análisis de las partículas individuales a medida que pasan a través de un nanopore es ventajoso para muestras multimodales como TRPS con éxito y eficacia pueden distinguir una gama de tamaños de partícula amonGST una sola muestra. Detección de pulso resistiva sintonizable completa tamaño ^10, potencial zeta ^12,18 y la concentración de ¹⁵ mediciones simultáneamente en una única ejecución y por lo tanto puede todavía diferenciar muestras de similar, si no el mismo tamaño por su carga de superficie ^19; una ventaja sobre las técnicas de encolado alternativos.

El potencial zeta se define como el potencial electrostático en el plano de cizallamiento ^20, y se calcula a partir de velocidades de las partículas a medida que atraviesan un poro ^19. mediciones de potencial zeta de las partículas individuales de este modo da una idea de los mecanismos y comportamiento de los sistemas de nanopartículas en solución, información valiosa para el futuro de los diseños de ensayo de nanopartículas para una gama de aplicaciones de translocación. análisis de partículas por partícula de tal naturaleza también permite la propagación y la distribución de los valores de potencial zeta entre una población de muestra para ser explorado, lo que permite más información ocinética de la reacción n (monocatenario a ADN de doble cadena, por ejemplo) y estabilidades de partículas en solución que hay que alcanzar.

A continuación, describimos una técnica que detecta y caracteriza a ambas superficies modificadas y no modificadas de ADN SPP. El protocolo descrito en el presente documento es aplicable a una gama de nanopartículas inorgánicas y biológicas, pero se demuestra el procedimiento de uso de superficies de ADN modificado debido a su amplia gama de aplicaciones. La técnica permite al usuario distinguir entre dianas de ADN de una sola hebra y de doble cadena en una superficie de las nanopartículas, basado en las velocidades de translocación de partículas a través de un sistema de poros y por lo tanto sus potenciales zeta.

Protocol

1. Hacer la solución tampón fosfato con Tween-20 (PBST) Buffer Disolver un comprimido de PBS (tampón fosfato 0,01 M, 0,0027 M cloruro de potasio, 0,137 M de cloruro de sodio, pH 7,4) en 200 ml de agua desionizada (18,2 mO cm). Añadir 100 ml (0,05 (v / v)%) de Tween-20 a la solución 200 ml de tampón como un agente tensioactivo. 2. Preparación de las Normas de partículas de poliestireno carboxilo Vortex las partículas de calibración para 30 segun…

Representative Results

Figura 1. Representación esquemática de los procesos de purificación magnética y una medición TRPS. A) Ejemplo de purificación magnética de la muestra a partir de una muestra que contiene exceso, sin unir ADN sonda de captura. B) TRPS ejemplo de medición i) de partículas que pasa por el nanoporos y ii) evento bloqueo producido a partir de partículas de ione…

Discussion

El cálculo para el potencial zeta utiliza un método basado calibración relacionados con el trabajo por Arjmandi et al. ^21. La duración de la translocación de las partículas a medida que atraviesan un nanopore se mide como una función de la tensión aplicada, utilizando un campo y de partículas promedio de las velocidades eléctricos sobre la totalidad de un poro cónica regular. La movilidad electroforética es el derivado de 1 / T (donde T es la duración del bloqueo) con respecto al v…

Materials

Phosphate buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich, UK	P4417	1 tablet dissolved in 200 mL deionised water to make buffer solution.
Tween-20	Sigma Aldrich, UK	P1379	0.05% (v/v) in PBS buffer as a surfactant
Carboxyl polystyrene nanoparticles	Bangs Laboratories, US	CPC200	Nominal diamter of 220 nm, raw concentration of 1E12 particles/mL, specific surface charge of 86 µeq/g (equivalent to a surface charge density of 3.2E19 C/nm^2.
Streptavidin coated nanoparticles	Ademtech, France	3121	Batch had binding capacity of 4352 pmol/mg (188 nM theoretical DNA binding capacity) at a raw concentration of 1.1E11 particles/mL.
Biotinylated oligonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Biotin modification at 3' end; Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences: CP 5'ATGGTTAAACCTCAC TACGCGTGGC[Btn]3'
Standard olignonucleotides	Sigma Aldrich, UK	VC00001	Supplier spec: Reverse Phase 1 purification (0.05 Scale); Lyophilised powders reconstituted to 100 µM using deionised water, and diluted as required. Sequences of DNA targets: Fully complementary – 5'GCCACGCGTAGTGAGGTTTAACCAT3', Middle binding – 5'GTAGTGAGGT3', End binding – 5'GTTTAACCAT3', Partially complementary overhanging – 5'GTGAGGTTTAACCAT TTTTTTTTTTTTTTT3'.
Izon qNano	Izon Science, NZ		Inherent pressure on system of 47 Pa,
Izon Variable Pressure Module (VPM)	Izon Science, NZ		Each 'cm' of pressure is equivalent to approximately 1000 Pa.
Polyurethane nanopore membranes	Izon Science, NZ	NP150	Analyte size range 60-480 nm, pore diameter of calculated to be 799 nm at a 45 mm stretch.
Magrack 6	GE Healthcare, UK	28-9489-64
Sonic Bath	Fisher Scientific, UK	10692353	80 Watts
Vortexer	IKA, Germany	0003365000
Rotary Wheel	Labnet International, US	H5500-230 V