RNAの測定方法<em> N</em<sup> 6</sup細胞や組織における> -methyladenosine変更

Summary

N ⁶ -methyladenosine（メートル⁶ A）RNAに修飾を測定するための修正されたノーザンブロット法が記載されています。現在の方法は、様々な実験デザインの下で多様なRNAおよびコントロールで変更を検出することができます。

Abstract

N⁶-Methyladenosine (m⁶A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m⁶A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m⁶A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m⁶A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m⁶A modifications in various sources of RNA. While m⁶A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m⁶A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N⁶-methyladenosine (m⁶A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes¹. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA². The m⁶A modifications of mRNA influence their splicing³, translation⁴, degradation⁵, and localization². Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function⁶. The evolutionary conservation of m⁶A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans⁷. Delineation of the roles of m⁶A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA⁸ also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms⁹, stem cell pluripotency¹⁰, triglyceride metabolism⁴, fibrosis¹¹, obesity¹², and major depression¹³ are a few examples of processes where m⁶A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m⁶A sites¹⁴. Modulation of m⁶A methylase or demethylase elicits circadian period changes¹⁵. Mettl3, an m⁶A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage¹⁰. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m⁶A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl4⁴. These studies reveal that m⁶A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m⁶A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m⁶A modifications of RNA^16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m⁶A in several RNAs^19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m⁶A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry²¹. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m⁶A-Seq)²² immunoprecipitates fragmented RNAs with m⁶A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m⁶A landscapes. High-resolution mapping of m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m⁶A modifications at a single-nucleotide resolution²³. Both methods provide details of m⁶A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m⁶A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m⁶A levels. To detect global m⁶A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis¹⁸. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m⁶A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

注：6レベルのrRNA、mRNAの、および他の小RNAを含むトータルRNAメートル。リボソームRNAが豊富メートル6 Aの変更を持っているので、メートルの測定6 Aレベルは、この事実を考慮する必要があります。 1. RNAの単離 （ペーパータオル上に噴霧）リボヌクレアーゼ除染液を使用して、ピペットと実験台の表面を拭いてください。ヌクレアーゼフリー水で濡れた紙タオル、再びピペットおよび実験台の表面を拭いてください。 RNA抽出全RNA単離オーバーヘッド撹拌機を用いて、4℃に維持し、RNA単離溶液1mLに組織の50~100ミリグラムまたは5~10×10 6個の細胞をホモジナイズします。 注：その他の組織（100-150 mg）をため、その中に低いRNA濃度のマウスからの脂肪組織サンプルのために必要となる場合があります。サンプルは、マウスの心臓、肝臓、骨格筋、肺、脳から供給、およびマクロファージは、以前4採用されています。 に室温で5分間、試料ホモジネートをcubate。 サンプルホモジネートの1ミリリットル当たり1-ブロモ-3-クロロプロパン（BCP）の100μLを加えます。 15秒間激しくチューブを振ると、製造元の指示24に従って全RNAを単離するために進んでください。 単離された全RNAからポリアデニル化mRNA精製入手可能なキットまたはプロトコルを使用してポリアデニル化mRNAを精製します。 次の各溶液を再懸濁するために徹底的に振る：結合液、オリゴ（dT）ポリスチレンビーズ、および洗浄溶液を2倍。オリゴ（dT）は使用前に室温に戻しビーズことを確認してください。 加熱ブロック中で70℃にチューブや熱に準備あたりの溶出溶液の120μLを転送します。 マイクロ遠心チューブに全RNAの500μgのまでピペット。ヌクレアーゼフリー水で、250μLに音量を調整します。 全RNAを2倍結合溶液の250μLを追加しますので、内容物を混合するための簡単リューションと渦。 オリゴの15μLを加える（DT）ビーズと渦が完全に混合します。 3分間70℃で混合物をインキュベートします。 加熱ブロックからサンプルを取り出して、それを10分間室温で放置しました。 2分間15,000×gで遠心分離します。 慎重に約50μLを残す、上清を除去します。 ピペッティングによりペレットを再懸濁するために洗浄溶液の500μLを追加します。 スピンフィルター/コレクションチューブセットにサスペンションをピペット。 2分間15,000×gで遠心分離します。コレクションチューブから列を削除し、フロースルーを捨てます。コレクションチューブにカラムを返します。 スピンフィルター上に洗浄溶液500μLをピペット。 15,000 xでの遠心分離 2分間グラム。 新鮮なコレクションチューブにスピンフィルターを転送します。 加熱された溶出液のピペット50μL70°Cにスピンフィルタの中心へ。 70℃で2〜5分間インキュベートします。 1分間15,000×gで遠心分離します。 スピンフィルターの中央に70℃に加熱し、溶出液の追加の50μLをピペット。 繰り返しステップ1.2.2.1.18。 100μg/ mLのグリコーゲン、3 M酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）、および無水エタノールの2.5倍量の0.1ボリュームを追加します。 -80℃で一晩沈殿させます。 4℃で25分間、15,000×gで遠心分離します。上清を捨てます。 75％エタノール1mLでペレットを洗浄。 4℃で15分間、15,000×gで遠心分離します。慎重にエタノールを除去。 3-5分間空気中で乾燥しました。 ペレットを溶解するためにヌクレアーゼフリー水10μLを追加します。 -70℃で保管してください。 RNA資格および定量分光光度計を使用して、NotIでによってRNA濃度を測定260 nmおよび280 nmの吸光度をngの。 A 260 / A 280比は1.8〜2.2でなければなりません。 0.8％アガロースゲル電気泳動25を用いて、RNAサンプルの品質を確認してください。 注：無傷の真核生物の全RNAは、強烈な28Sおよび18S rRNAバンドを示すべきです。良いRNA調製のための18S rRNAのバンド強度対28Sの割合は約2です。 2.ゲル電気泳動および転送注意：バッファ調製プロトコルを表1に示します。 ホルムアルデヒドゲル調製（1％） ジエチル（DEPC）水と、すべての電気機器をすすぎます。 DEPC水215 mL中に完全に電子レンジでアガロース2.5gのメルト。 10倍3-（N-モルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）の12.5 mLの緩衝液および37％ホルムアルデヒドの22.5 mLを加え。 1.5ミリメートルの厚さのくしと電気泳動装置にそれを注ぎます。 トン気泡を排除またはプッシュきれいな櫛でのゲルのエッジに裾。 ゲルは室温で固化することを可能にします。 試料調製サンプルバッファの全RNAの1-10μgの11.3μLを混ぜます。 サンプルバッファの11.3μLとRNAマーカー（を1μg/μL）の2μgのを混ぜます。 2.2.1および2.2.2からの16μLの総容量にサンプルにヌクレアーゼフリー水を追加します。 5分間60℃で加熱し、次いで氷上で冷やします。 氷の上では0.1μg/μLのエチジウムブロマイドが含まれている追跡用色素の4μL、と2.2.3からの試料16μLを混ぜます。 注意：吸入するとエチジウムブロマイドはおそらく催奇形性や毒性があります。エチジウムブロマイド安全データシートをお読みください。 電気泳動 10×MOPSの200 mLの1×MOPSランニングバッファーを作るためのddH 2 Oの1800 mLにバッファを追加します。 ゲルのウェルを洗浄するために、1×MOPSランニングバッファーを使用してください。 プレラントン彼は5分間、20Vでゲル。 ゲルのウェルにRNAサンプルをロードします。 光暴露を避けるためにホイルで覆います。約17時間（一晩）35 Vで実行します調べ、UV光下でゲルを撮影。 移転未使用部分を除去するためにゲルをカットします。 10×SSC緩衝液（20×SSC緩衝液の250ミリリットルとDEPC水の250 mL）を500 mLのを準備します。 50 rpmで振とうしながら20分間、10×SSC緩衝液で2回ゲルを洗浄してください。 搬送用トレイ（ 図1）から転送バッファを吸収芯紙、として機能するのに十分な大き1フィルタ紙をカットします。 ゲルと同じ大きさにろ紙の4枚をカット。 ゲルと同じ大きさに正に帯電したナイロン膜の1シートをカット。 ゲル上のノッチと適切な向きを確保するためのマーカーとしての膜をマークします。 15分間、2×SSC緩衝液中で膜を浸します。 500 mLのOを注ぎますF 10倍SSC転送トレイにバッファー。 ガラス板を横切って大きなフィルタ紙を置き、転写緩衝液で濾紙を濡らします。 ピペットで気泡をロールアウト。 転送バッファにプレカットろ紙の2枚を浸し、ステップ2.4.5からろ紙の中央に配置します。任意の気泡を除去。 ろ紙上にゲルのトップ側を下にして置きます。 ゲルの上に膜を置きます。ゲルとメンブレンのノッチを合わせます。 膜の上にプレカット濾紙の2枚を配置し、転写緩衝液で濾紙を濡らします。 層の間の任意の気泡を除去。 タオルだけゲルと膜を通過バ​​ッファを吸い取ることを保証するために、ゲルの周りにラップを適用します。 ろ紙の上にペーパータオルをスタック。 タオルの上に特大のガラス板を置きます。 スタックの一番上に重量を配置します。 RNAは、膜にゲルから転送できるようにするために一晩保管してください。 N 6 -methyladenosineの3検出膜架橋 2×SSC緩衝液で湿った膜を保管してください。 UVクロスリンカーに10×SSC緩衝液で浸した濾紙の2枚を置きます。 RNA吸着側を上に向けて、ろ紙の上に膜を配置します。 「autocrosslinkモード」（12万μJ）を選択し、照射を開始するために、「スタート」ボタンを押してください。 ゲルからメンブレンへのRNA転写を確認するために、UVゲルイメージキャッチャーを有する膜およびゲルを調べます。 免疫ブロット法 1時間室温でトゥイーン20（TBST）緩衝液を用いてトリス緩衝生理食塩水、5％脱脂乳で膜をブロックします。 15分間、TBST緩衝液で3回洗浄します。 一晩メートル6 A（中膜をインキュベート<EM> N 6 -methyladenosine）抗体溶液（1：5％脱脂乳TBSTバッファー1,000）4℃。 15分間、TBST緩衝液で3回膜を洗浄します。 室温で1時間（5％の脱脂乳TBST緩衝液中2,000 1）HRP結合ロバ抗ウサギ抗体溶液中で膜をインキュベートします。 15分間、TBST緩衝液で3回膜を洗浄します。 強化された化学発光基質（膜の1cm 2当たり0.125ミリリットル）を適用します。 製造元の指示26に従って、デジタルイメージャの最適な設定で化学発光をキャプチャします。 メートル6定量 ImageJソフトウェアを使用して相対メートル6 A化学発光強度を測定します。 ImageJソフトウェアのメニューで、該当するファイルを開くには、「ファイル」オプションを選択します。 ImageJのから「矩形」ツールを選択し、周囲に枠を描きます信号。 リボソームRNAは、実験の焦点でない場合は、計算のための18Sおよび28SリボソームRNAメートル6 Aバンドを避けます。 選択された車線を確認するために「コマンド」と「1」をクリックしてください。 押して「コマンド」と「3」が選択されたプロットを表示します。 「ストレート」ツールをクリックし、セグメント化された領域を分離するために線を引きます。 測定値を記録するために「ワンド」ツールをクリックします。 データをエクスポートします。 臭化エチジウム染色から18SリボソームRNAのバンドを持つメートル6 Aのレベルを標準化します。

Representative Results

通常の明暗概日相で14日後に、野生型マウスは、一定の暗闇の中に入れました。肝臓からのRNAは、4時間間隔でサンプリングし、変更されたノーザンブロット法で検討しました。 rRNA、mRNAを、と小さなRNAのメチル化は、明らかに（ 図2）を検出しました。別の概日時間（CT）との間の比較は、正確に、18S rRNAの標準を用いて計算することができます。 rRNAを、mRNAを、および低分子RNAでメートル6 Aレベルの堅牢な概日振動がありました。 リボソームRNAによって差し出さ干渉を回避するために、ポリアデニル化RNAは、ステップ1.2.2のように、精製することができます。精製後、rRNAが大きく、他のRNA（ 図3）のより良好な視覚化を可能にするために除去することができます。 <stronグラム>図1：ブロットトランスファーユニットの組み立て。メンブレンへのRNAをブロッティング用のキャピラリートランスファーユニットが示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図2：C57BL / 6Jマウスにおけるメートル6 Aレベルの概日リズム。この図はメートル6野生型マウスの肝臓からの全RNAのブロットは、4時間の間隔で、通常の明暗相の14日後に暗暗期の最初の日に犠牲に示しています。定量化は、M 6 18Sおよび28S rRNAの間の画像の濃度差を用いて行きました。メートル6存在量は一番下にホルムアルデヒドゲルから18S rRNAのバンドに標準化しました。ら= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 図3：メートル6 Aブロットを持つかのrRNAなし。代表的なmが野生型マウスの肝臓からの全RNAおよびポリアデニル化RNAの6 Aブロットが示されています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 1 10×MOPS緩衝液（pH 7.0、光から保護します） MOPS 41.85 グラム 0.2 M 酢酸ナトリウム 4.1 グラム0.05 M EDTA、二ナトリウム塩 3.7 グラム 0.01 M DEPC水合計 1 L 室温で撹拌 2 20×SSC緩衝液（pH7.0） 塩化ナトリウム 175.3 グラム 3 M クエン酸三ナトリウム 88.3 グラム 0.3 M DEPC水合計 1 L </td> 室温で攪拌し、その後、オートクレーブ 3 追跡用色素 10×MOPS緩衝液 500 μL 1倍フィコール400 0.75 グラム 15％ ブロモフェノールブルー 0.01 グラム 0.2％ キシレンシアノール 0.01 グラム 0.2％ DEPC水合計 5 mLの -20°Cで保存 4 DEPC水 1割合を希釈：DEPCの1,000のddH 2 Oに室温で一晩攪拌し、その後、オートクレーブ 5 サンプルバッファー（光から保護） 10×MOPS緩衝液 200 μL 37％ホルムアルデヒド 270 μL ホルムアミド 660 μL -20°Cで保存</tboDY> 表1：バッファおよびソリューションを提供しています。

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded⁸. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications²⁷.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA^28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m⁶A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA²². It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m⁶A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult¹⁸. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m⁶A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing³⁰. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control³¹. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Materials

RNaseZap solution	Ambion	AM9782	Protocol 1.1
TRI Reagent solution	Ambion	AM9738	Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Sigma	B9673	Protocol 1.2.1.3
Ethanol	JTbaker	8006	Protocol 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocol 1.2.2.1
Glycogen	Ambion	AM9510	Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate	Fluka	71183	Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water	Ambion	AM9930	Protocol 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocol 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocol 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution	Sigma	F8775	Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt	JT Baker	8993	Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide	Sigma	F7503	Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide	Amresco	X328	Protocol 2.2.5
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue	Sigma	114391	Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol	Sigma	X4126	Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride	JT Baker	3624	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate	Sigma	S1804	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine)	Synaptic Systems	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab	GE Healthcare	NA934	Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protocol 3.2.8