RNA 측정 방법<em> N</em<sup> 6</sup세포와 조직에서> -methyladenosine 수정

Summary

RNA에 N ⁶ -methyladenosine (m ⁶ A) 변형을 측정하기위한 수정 북부 블로 팅 방법을 설명한다. 현재의 방법은 여러 가지 실험 설계에 따라 다양한 RNA를에서 수정 및 컨트롤을 감지 할 수 있습니다.

Abstract

N⁶-Methyladenosine (m⁶A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m⁶A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m⁶A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m⁶A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m⁶A modifications in various sources of RNA. While m⁶A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m⁶A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N⁶-methyladenosine (m⁶A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes¹. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA². The m⁶A modifications of mRNA influence their splicing³, translation⁴, degradation⁵, and localization². Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function⁶. The evolutionary conservation of m⁶A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans⁷. Delineation of the roles of m⁶A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA⁸ also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms⁹, stem cell pluripotency¹⁰, triglyceride metabolism⁴, fibrosis¹¹, obesity¹², and major depression¹³ are a few examples of processes where m⁶A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m⁶A sites¹⁴. Modulation of m⁶A methylase or demethylase elicits circadian period changes¹⁵. Mettl3, an m⁶A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage¹⁰. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m⁶A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl4⁴. These studies reveal that m⁶A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m⁶A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m⁶A modifications of RNA^16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m⁶A in several RNAs^19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m⁶A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry²¹. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m⁶A-Seq)²² immunoprecipitates fragmented RNAs with m⁶A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m⁶A landscapes. High-resolution mapping of m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m⁶A modifications at a single-nucleotide resolution²³. Both methods provide details of m⁶A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m⁶A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m⁶A levels. To detect global m⁶A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis¹⁸. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m⁶A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

참고 : 6 수준은 rRNA의, mRNA를, 및 기타 소형의 RNA를 포함 총 RNA의 m. 리보솜 RNA 풍부한 m 6 수정,도 6a 레벨이 사실을 고려할 필요가 m의 측정을 가지고 있기 때문이다. 1. RNA 분리 (종이 타월에 분사)가 리보 뉴 클레아 제의 오염 제거 용액을 사용하여, 피펫 및 실험실 벤치의 표면을 닦으십시오. 젖은 종이 클레아없는 물과 수건을 다시 피펫 및 실험실 벤치 표면을 닦아. RNA 추출 총 RNA 분리 오버 헤드 교반기를 사용하여, 조직을 50 내지 100 mg을 4 ℃에서 유지 RNA 분리 액 1ml에 5 내지 10 × 106 세포를 균질화시킨다. 주 : 자세한 조직 (100-150 mg)을하기 때문에 내부 하부 RNA 농도 생쥐 지방 조직 샘플에 대해 요구 될 수있다. 샘플은 마우스 심장, 간, 골격근, 폐, 뇌에서 공급하고, 대 식세포는 이전에 4 사용되어왔다. 에서실온에서 5 분 동안 샘플을 균질화 cubate. 샘플 파쇄 1 ㎖ 당 1- 브로 모 -3- 클로로 프로판 (BCP) 100 μL를 추가한다. 15 초 동안 적극적으로 튜브를 흔들 제조업체의 지침 (24)에 따라 총 RNA를 분리로 진행합니다. 격리 된 총 RNA에서 폴리아 데 닐화 mRNA의 정제 사용 가능한 키트 또는 프로토콜을 사용하여 폴리아 데 닐화의 mRNA를 정화. 다음 솔루션의 각을 다시 중단 철저하게 흔들어 : 배 결합 솔루션, 올리고 (DT) 폴리스티렌 구슬 및 세척 솔루션을. 올리고 (DT)를 사용하기 전에 실온에 따뜻한 비즈 있는지 확인합니다. 가열 블럭에서 70 ℃로 튜브 열로 제조 당 용출 용액 120 μL를 옮긴다. 미세 원심 관에 총 RNA의 500 μg의 최대 피펫. 클레아없는 물로, 250 μL에 볼륨을 조정합니다. 총 RNA에 2 배 결합 액 250 μL를 추가하기 때문에lution와 소용돌이 짧게 내용을 혼합합니다. 올리고 15 μL를 추가 (DT) 구슬과 소용돌이는 철저하게 혼합합니다. 3 분 동안 70 ℃에서 혼합물을 인큐베이션. 가열 블록의 샘플을 제거하고 10 분 동안 실온에서 서하자. 2 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 뒤 약 50 μL를 떠나, 뜨는을 제거합니다. 피펫으로 펠렛을 다시 중단 세척 용액 500 μL를 추가합니다. 스핀 필터 / 수집 튜브 세트로 현탁액을 피펫. 2 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 포집 관에서 열을 제거하고 흐름을 통해 폐기하십시오. 수집 튜브에 열을 돌려줍니다. 스핀 필터 상에 세척 용액의 피펫 500 μL. 15,000 X 원심 분리기 2 분 동안 g. 신선한 수집 관에 스핀 필터를 전송합니다. 용출 용액의 피펫 50 μL 가열70 ° C 스핀 필터의 중심 상. 70 ℃에서 2-5 분 동안 품어. 1 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 스핀 필터의 중심에 70 ° C로 가열 용출 용액의 추가 50 μL 피펫. 단계를 반복 1.2.2.1.18. 100 μg의 / ㎖ 글리코겐, 3 M 아세트산 나트륨 완충액 (pH 5.2), 및 무수 에탄올 2.5 부피 0.1 볼륨. -80 ° C에서 하룻밤 침전. 4 ℃에서 25 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. 75 % 에탄올 1 mL로 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 15 분 동안 15,000 XG에 원심 분리기. 조심스럽게 에탄올을 제거합니다. 3-5 분 동안 공기 건조. 펠렛을 용해 뉴 클레아없는 물 10 μL를 추가합니다. -70 ° C에서 보관하십시오. RNA 자격 및 정량화 분광 광도계를 사용하여, NotI에 의해 RNA의 농도를 결정260 nm 내지 280 nm에서의 흡광도 겨. 다음은 260 / A 280 비율은 1.8-2.2해야합니다. 0.8 % 아가 로스 겔 전기 영동 (25)를 사용하여 RNA 샘플 품질을 확인합니다. 참고 :이 그대로 진핵 총 RNA는 강렬한 28S와 18S rRNA의 밴드를 표시해야합니다. 좋은 RNA 준비를위한 18S rRNA의 밴드 강도를 비교 28S의 비율은 1 ~ 2이다. 2. 젤 전기 영동 및 전송 참고 : 버퍼 준비 프로토콜은 표 1에 제시되어있다. 포름 알데히드 젤 준비 (1 %) 디 에틸 피로 카보 (DEPC) 물과 모든 전기 장비를 씻어. 완전히 전자 레인지 DEPC 물 215 ㎖의 2.5 g 아가 용융. 10 배 3- (N- 모르 폴리 노) 프로판 술폰산 (MOPS)의 12.5 mL의 버퍼와 37 %의 포름 알데히드 22.5 mL를 넣고. 1.5 mm 두께의 빗 전기 영동 장치에 그것을 따르십시오. t 거품을 제거 또는 푸시깨끗한 빗과 젤의 가장자리에 밑단. 겔은 실온에서 응고 할 수 있습니다. 샘플 준비 샘플 버퍼의 총 RNA의 1-10 μg의 11.3 μL를 섞는다. 샘플 버퍼의 11.3 μL와 RNA 마커 (1 μg의 / μL) 2 μg의 혼합. 16 μL의 총 볼륨 2.2.1과 2.2.2에서 샘플 뉴 클레아없는 물을 추가합니다. 5 분 동안 60 ℃에서 가열 한 후 얼음에 진정. 얼음 / μL 에티 디움 브로마이드 0.1 μg의를 포함 추적 염료의 4 μL와 2.2.3에서 샘플 16 μL를 섞는다. 주의 : 흡입하면 에티 디움 브로마이드 가능성이 기형 독성이다. 에티 디움 브로마이드 물질 안전 보건 자료를 참조하십시오. 전기 영동 10 배 MOPS의 200 ㎖가 1 배 MOPS 실행 버퍼를 만들기 위해 DDH 2 O의 1,800 mL의 버퍼에 추가합니다. 젤의 우물을 씻어하기 위해 1 배 MOPS 실행 버퍼를 사용합니다. 사전 실행 t그는 5 분 동안 20 V에서 젤. 겔의 우물에 RNA 샘플을로드합니다. 빛의 노출을 방지하기 위해 호일로 커버. (야간) 약 17 시간 동안 35 V에서 실행 검사 및 자외선 아래에서 젤을 촬영. 이전 사용되지 않는 부분을 제거하는 젤을 잘라. 10 배 SSC 버퍼 (20 배 SSC 버퍼의 250 mL의 DEPC 물 250 mL)을 500 ㎖를 준비합니다. 50 rpm으로 진탕 20 분 동안 10 배 SSC 버퍼로 두 번 젤을 씻으십시오. 반송 트레이 (도 1)로부터 전송 버퍼를 흡수 심지 종이의 역할을하기에 충분히 큰 1 필터 종이 낱장. 젤과 같은 크기로 종이 필터 4 조각을 잘라. 겔과 같은 크기로 양전하 나일론 막 중 1 매를 잘랐다. 겔의 노치와 올바른 방향을 보장하기 위해 마커로 막을 표시합니다. 15 분 동안 2 × SSC 완충액에서 막을 담근다. 500 mL의 O를 붓고F 10 배 SSC 전송 트레이에 버퍼. 유리판을 가로 지르는 큰 필터 종이 시트를 놓고 전송 버퍼 여과지 젖은. 피펫있는 모든 거품을 굴립니다. 전송 버퍼에 미리 차단 필터 종이의 2 개를 적시 단계 2.4.5에서 여과지의 중앙에 배치합니다. 모든 거품을 제거합니다. 아래 필터 종이에 젤 상단 측을 놓습니다. 겔의 상단에 막을 놓습니다. 겔과 멤브레인의 노치에 맞 춥니 다. 멤브레인 위에 프리 컷 여과지의 2 개를 배치하고 전송 버퍼 여과지 젖은. 층 사이의 거품을 제거합니다. 수건은 겔 멤브레인을 통과 버퍼를 흡수되도록하여 겔 주위에 랩을 적용합니다. 필터 종이 위에 종이 타월 스택. 수건 위에 대형 유리 접시를 놓습니다. 스택의 상단에 무게를 둡니다. RNA가 막에 겔로부터 전송할 수 밤새 유지. N 6 -methyladenosine 3. 검출 막 가교 배 SSC 버퍼에 젖은 멤브레인을 유지합니다. UV 가교제에 10 배 SSC 버퍼에 몰입 필터 종이 2 장을 놓습니다. RNA의 흡착면이 위를 향하도록, 여과지 위에 멤브레인을 놓습니다. "autocrosslink 모드"(12 μJ)를 선택하고 조사를 시작하기 위해 "시작"버튼을 누릅니다. 멤브레인을 겔에서 RNA의 전사를 확인하기 위해 UV 겔 화상 포수 막 겔을 조사한다. 면역 실온에서 1 시간 동안 트윈 -20 (TBST) 완충액 TBS 버퍼에서 5 % 무 지방 우유 막을 차단. 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 씻으십시오. 밤새 m (6) A (에 멤브레인을 품어 <EM> N 6 -methyladenosine) 항체 용액 (1 : 1,000 5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼) 4 ° C에서. 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 멤브레인을 씻으십시오. 실온에서 1 시간 동안 (5 % 무 지방 우유 TBST 버퍼 2000 1) HRP 접합 된 당나귀 항 – 토끼 항체 용액의 막을 인큐베이션. 15 분 동안 TBST 완충액으로 세 번 멤브레인을 씻으십시오. 강화 된 화학 발광 기판 (막 cm 2 당 0.125 ml)에 적용합니다. 제조자의 지시 (26)에있어서, 상기 디지털 영상 기의 최적 설정으로 화학 발광 캡처. m 6 정량화 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 상대 m 6 화학 발광 강도를 측정한다. ImageJ에 소프트웨어 메뉴 아래에서 해당 파일을 열 수있는 "파일"옵션을 선택합니다. ImageJ에에서 "직사각형"도구를 선택하고 주변에 프레임을 그립니다신호. 리보솜 RNA는 실험의 초점없는 경우 계산을위한 18S 및 28S 리보솜 RNA m도 6A 대역을 피한다. 선택한 차선을 확인하는 "명령"과 "1"을 클릭합니다. 보도는 "명령"과 "3"선택한 플롯을 표시합니다. 가 "STRAIGHT"도구를 클릭하고 분할 영역을 구분하는 선을 그립니다. 측정 값을 기록하기 위해 "지팡이"도구를 클릭합니다. 데이터를 내 보냅니다. 에티 디움 브로마이드 염색 중 18S 리보솜 RNA 밴드 m (6) (A)의 레벨을 정규화한다.

Representative Results

정상 명암 주기성 단계 14 일 후에 야생형 마우스 상수 어둠 속에 넣었다. 간에서 RNA를 4 시간 간격으로 샘플링 및 수정 북부 블로 팅으로 연구 하였다. rRNAs, mRNA를, 작은 RNA를의 메틸화는 명확하게 (그림 2) 검출되었다. 상이한 주기성 시간 사이의 비교 (CT)을 정확하게 18S rRNA의 기준을 산출 할 수있다. rRNA의, mRNA를, 작은 RNA를에서 m 6 수준의 강력한 일중 진동이 있었다. rRNA의 proffered 의해 간섭을 방지하기 위해, 폴리아 데 닐화 RNA를 단계 1.2.2와 같이 정제 될 수있다. 정제 후, rRNA의 크게 다른 RNA를 (도 3)의보다 나은 시각화를 허용하도록 제거 될 수있다. <stron g>도 1 : 오 이송 유닛 조립. 멤브레인에 블 롯팅을위한 RNA를 모세관 반송 유니트가 도시되어있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 : C57BL / 6J 마우스의 m 6 수준의 활동 일주기. 이 그림은 m 6 야생형 생쥐의 간에서 총 RNA의 얼룩은 4 시간 간격으로 정상 명암 단계 14 일 이후에 어두운 어두운 단계의 첫 번째 날에 희생 보여줍니다. 정량화는 6 m 18S와 28S rRNA의 사이의 화상 농도의 차이를 사용하여 수행 하였다. m 개의 6 풍요 로움은 맨 아래에있는 포름 알데히드 겔에서 18S rRNA의 대역으로 표준화되었다.등 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3 : 또는 rRNA의없는 m 6의 말. 대표 m는 총 RNA와 야생형 생쥐의 간에서 폴리아 데 닐화 RNA의 6 롯이 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 1 10 배 MOPS 완충액 (pH 7.0, 빛으로부터 보호) MOPS 41.85 지 0.2 M 아세트산 나트륨 4.1 지 0.05 M EDTA,이 나트륨 소금 3.7 지 0.01 M DEPC 물 합계 1 엘 실온에서 교반 이 20 배의 SSC 완충액 (pH 7.0) 염화나트륨 175.3 지 3 M 트리 소듐 시트 레이트 88.3 지 0.3 M DEPC 물 합계 1 엘 </td> 실온에서 교반 한 후, 오토 클레이브 삼 추적 염료 10 배 MOPS 버퍼 (500) μL 1 배 피콜 (400) 0.75 지 15 % 블루 브로 모 페놀 0.01 지 0.2 % 크실렌 Cyanol 0.01 지 0.2 % DEPC 물 합계 (5) mL의 스토어 -20 ° C에서 4 DEPC 물 1 비율로 희석 : DEPC의 1,000 DDH 2 O에 실온에서 밤새 교반 한 후, 오토 클레이브 (5) 샘플 버퍼 (빛으로부터 보호) 10 배 MOPS 버퍼 (200) μL 37 % 포름 알데히드 (270) μL 포름 아미드 (660) μL 스토어 -20 ° C에서 </tboDY> 표 1 : 버퍼 및 솔루션을 제공합니다.

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded⁸. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications²⁷.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA^28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m⁶A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA²². It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m⁶A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult¹⁸. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m⁶A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing³⁰. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control³¹. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Materials

RNaseZap solution	Ambion	AM9782	Protocol 1.1
TRI Reagent solution	Ambion	AM9738	Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Sigma	B9673	Protocol 1.2.1.3
Ethanol	JTbaker	8006	Protocol 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocol 1.2.2.1
Glycogen	Ambion	AM9510	Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate	Fluka	71183	Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water	Ambion	AM9930	Protocol 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocol 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocol 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution	Sigma	F8775	Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt	JT Baker	8993	Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide	Sigma	F7503	Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide	Amresco	X328	Protocol 2.2.5
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue	Sigma	114391	Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol	Sigma	X4126	Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride	JT Baker	3624	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate	Sigma	S1804	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine)	Synaptic Systems	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab	GE Healthcare	NA934	Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protocol 3.2.8