שיטה למדידת RNA<em> N</em⁶ שינויי -methyladenosine ב תאים ורקמות

Summary

שיטה סופגת צפונית שונה למדידת N ⁶ -methyladenosine (מ ⁶ א) שינויים ב RNA מתוארת. השיטה הנוכחית יכולה לזהות שינויים ב RNAs ובקרות מגוונות תחת עיצובים ניסיוניים שונים.

Abstract

N⁶-Methyladenosine (m⁶A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m⁶A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m⁶A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m⁶A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m⁶A modifications in various sources of RNA. While m⁶A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m⁶A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

Introduction

Dynamic and reversible RNA modifications have important roles in RNA homeostasis. Four decades ago, N⁶-methyladenosine (m⁶A) modifications were found to be abundant in eukaryotic transcriptomes¹. They have diverse functions in messenger RNA (mRNA), ribosomal RNA (rRNA), small nucleolar RNA, transfer RNA, and microRNA². The m⁶A modifications of mRNA influence their splicing³, translation⁴, degradation⁵, and localization². Moreover, they affect ribosome biogenesis and microRNA function⁶. The evolutionary conservation of m⁶A modifications of RNA is noted in unicellular bacteria to multi-cellular humans⁷. Delineation of the roles of m⁶A modifications is currently under extensive exploration. The efforts are expected to provide new insights into transcription control. Recent studies reveal that other chemical modifications of mRNA⁸ also play critical roles in RNA metabolism.

Circadian rhythms⁹, stem cell pluripotency¹⁰, triglyceride metabolism⁴, fibrosis¹¹, obesity¹², and major depression¹³ are a few examples of processes where m⁶A modifications are known to control outcomes. Many circadian clock gene transcripts have m⁶A sites¹⁴. Modulation of m⁶A methylase or demethylase elicits circadian period changes¹⁵. Mettl3, an m⁶A transferase, is a regulator for stem cell pluripotency. A deficiency of Mettl3 leads to early embryonic lethality and aberrant lineage priming at the post-implantation stage¹⁰. A deficiency of fat mass- and obesity-associated (FTO), an m⁶A demethylase, in adipocytes affects fatty acid mobilization and body weight through posttranscriptional regulation of Angptl4⁴. These studies reveal that m⁶A not only controls mRNA processing, but also plays critical roles in embryological development and patho-physiology. The function of m⁶A modifications holds implications for therapeutic considerations in the future.

Several methods are available to measure m⁶A modifications of RNA^16-18. Traditionally, thin layer chromatography (TLC) and high-performance liquid chromatography (HPLC) are used to study the distribution of m⁶A in several RNAs^19,20. Mass spectrometry is a sensitive tool for the detection of m⁶A modifications in RNA. However, the RNA needs to be excised by RNase into short fragments before analysis by mass spectrometry²¹. Methyl-RNA immunoprecipitation and sequencing (m⁶A-Seq)²² immunoprecipitates fragmented RNAs with m⁶A-specific antibodies and performs parallel RNA sequencing. This method generates transcriptome-wide m⁶A landscapes. High-resolution mapping of m⁶A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation (miCLIP) further maps m⁶A modifications at a single-nucleotide resolution²³. Both methods provide details of m⁶A modification across the whole transcriptome, with specific genes’ information. However, quantifications and standardization in both methods are difficult if experiments require the comparison of multiple conditions. Moreover, fragmentations of RNA for m⁶A-Seq alter the original RNA structure, which may affect native m⁶A levels. To detect global m⁶A modifications of RNA and their changes under different experimental conditions, we report a method that employs a modified northern blotting protocol. This method resolves RNA by molecular weight, using gel electrophoresis¹⁸. This procedure provides better standardization and quantifications for experiments that involve multiple conditions or samples. It also provides specific m⁶A modification information for different RNAs, whether rRNA, mRNA, or microRNA.

Protocol

הערה: רנ"א הכל מ 6 רמה כוללת rRNA, mRNA, ו RNA קטנים אחרים. מאז RNA ריבוזומלי יש מ שופע 6 שינויים A, מדידת מ 6 הבגרויות תצטרך לשקול את העובדה הזו. בידוד RNA 1. באמצעות פתרון טיהור ribonuclease (מרוסס על מגבות נייר), לנגב את טפטפות ומשטחי ספסל מעבדה. מגבות נייר רטובות עם מי nuclease ללא ולנגב טפטפות ומשטחי ספסל במעבדה שוב. הפקת RNA בידוד RNA סה"כ שימוש בוחש עילי, homogenize 50-100 מ"ג של רקמה או 5-10 x 10 6 תאים 1 מ"ל של תמיסת בידוד RNA שמרו על 4 מעלות צלזיוס. הערה: רקמה יותר (100-150 מ"ג) עשויה להידרש דגימות רקמה שומניות מעכברים בגלל ריכוזי RNA הנמוכים בו. דוגמאות שמקורו מן הלב העכבר, כבד, שרירי השלד, ריאות, מוח, מקרופאגים הועסק 4 בעבר. בcubate homogenates מדגם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. הוספת 100 μL של 1-bromo-3-chloropropane (BCP) לכל 1 מ"ל של homogenate המדגם. לנער את צינורות בתוקף למשך 15 שניות ולהמשיך לבודד רנ"א הכל על פי הוראות היצרן 24. Polyadenylated mRNA טיהור מ- RNA סה"כ מבודד לטהר mRNA polyadenylated באמצעות ערכות או פרוטוקולים זמינים. לנער היטב מחדש להשעות כל אחד מהפתרונות הבאים: פתרון מחייב 2x, אוליגו חרוזי פוליסטירן (DT), והפתרון לשטוף. ודא אוליגו (DT) חרוזים חם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. העבר 120 μL של פתרון elution לכל הכנה לתוך צינור וחום עד 70 ° C בתוך גוש חימום. פיפטה עד 500 מיקרוגרם של רנ"א הכל לתוך צינור microcentrifuge. עם nuclease ללא מים, להתאים את עוצמת הקול כדי 250 μL. הוסף 250 μL של פתרון מחייב 2x אל רנ"א הכל כךlution מערבולת בקצרה לערבב את תוכנו. הוסיפו 15 μL של אוליגו (DT) חרוז מערבולת ביסודיות לערבב. דגירה את התערובת על 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות. הסר את המדגם מגוש החימום ולתת לו לעמוד בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. מוציאים בזהירות את supernatant, משאיר מאחוריו כ 50 μL. הוספת 500 μL של פתרון לשטוף מחדש להשעות את הגלולה ידי pipetting. פיפטה ההשעיה לתוך מערכת צינור ספין מסנן / אוסף. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 2 דקות. הסר את עמודת צינור איסוף וזורק את הזרימה דרך. החזר את עמודת צינור האיסוף. פיפטה 500 μL של פתרון לשטוף על מסנן הספין. צנטריפוגה ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות. מעביר את מסנן הספין לתוך צינור איסוף טרי. פיפטה 50 μL של פתרון elution מחומםעד 70 ° C על גבי במרכז מסנן הספין. דגירה של 2-5 דק 'ב 70 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG דקות 1. פיפטה נוסף 50 μL של פתרון elution מחומם ל -70 מעלות צלזיוס על גבי במרכז מסנן הספין. חזור על שלב 1.2.2.1.18. הוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​גליקוגן, 0.1 נפח של 3 M חיץ נתרן אצטט (5.2 pH), ו 2.5 כרכים של אתנול אבסולוטי. משקע הלילה ב -80 ° C. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 25 דקות ב 4 °. בטל supernatant. שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול 75%. צנטריפוגה ב 15,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. מוציאים בזהירות את אתנול. יבש באוויר במשך 3-5 דקות. הוסף 10 μL של מי nuclease ללא לפזר את הגלולה. חנות ב -70 ° C. הכשרת RNA וכימות באמצעות ספקטרופוטומטר, לקבוע את ריכוז RNA על ידי NotIng את הספיגה ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר. יחס 260/280 צריך להיות 1.8-2.2. בדוק את איכות המדגם RNA באמצעות 0.8% ג'ל agarose אלקטרופורזה 25. הערה: רנ"א הכל ללא פגע איקריוטיים צריך להראות 28S אינטנסיבי 18S rRNA להקות. יחס 28S לעומת עוצמת להקת 18S rRNA עבור הכנת RNA טובה הוא ~ 2. 2. ג'ל אלקטרופורזה והסעה הערה: הפרוטוקולים כן חיץ ניתנים בטבלת 1. הכנת ג'ל פורמלדהיד (1%) יש לשטוף את כל הציוד אלקטרופורזה עם diethylpyrocarbonate (DEPC) מים. ממיסים 2.5 גרם של agarose ב 215 מ"ל מים DEPC לחלוטין במיקרוגל. הוסף 12.5 מ"ל של 10x 3- (N- morpholino) חומצה propanesulfonic (מגבים) חיץ 22.5 מ"ל של פורמלדהיד 37%. יוצקים את התערובת לתבנית המנגנון אלקטרופורזה עם מסרק סמיך 1.5 מ"מ. לחסל בועות או לדחוף tשולי עד הקצוות הג'ל במסרק נקי. אפשר הג'ל לחזק בטמפרטורת החדר. לדוגמא הכנה מערבבים 1-10 מיקרוגרם של RNA סך 11.3 μL של חיץ מדגם. מערבבים 2 מיקרוגרם של הסמן RNA (1 מיקרוגרם / μL) עם 11.3 μL של חיץ מדגם. מוסיפים מים nuclease ללא דגימות 2.2.1 ו 2.2.2 כדי בהיקף כולל של 16 μL. מחממים על 60 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולאחר מכן לצנן על הקרח. מערבבים 16 μL של המדגם מ 2.2.3 עם 4 μL של צבע מעקב, המכיל 0.1 מיקרוגרם / μL ethidium ברומיד על הקרח. זהירות: ברומיד Ethidium הוא אולי טרטוגניות ורעילים אם נשאף. קרא גליון בטיחות ברומיד ethidium. אלקטרופורזה הוסף 200 מ"ל של 10x מגבים חיץ ל -1,800 מ"ל של DDH 2 O לבצע למאגר פועל מגבים 1x. השתמש למאגר פועל מגבי 1x לשטוף את הבארות של ג'ל. t טרום ריצההוא הג'ל על 20 V למשך 5 דקות. טען את דגימות רנ"א לתוך הבארות של ג'ל. מכסים בנייר כסף, כדי למנוע חשיפה לאור. הפעלה ב 35 V עבור כ -17 שעות (לילה) בדוק ולצלם את הג'ל תחת אור UV. לְהַעֲבִיר חותכים את ג'ל להסרת החלק בשימוש. הכן 500 מ"ל של 10x חיץ SSC (250 מ"ל של חיץ 20x SSC ו 250 מ"ל מים DEPC). שטפו את הג'ל פעמיים עם חיץ 10x SSC במשך 20 דקות עם רועד ב 50 סל"ד. חותכי 1 נייר סינון גיליון גדול מספיק כדי לשמש נייר פתילה, אשר סופג חיץ העברה ממגש ההעברה (איור 1). חותכים 4 חתיכות של נייר סינון לאותו גודל כמו ג'ל. חותכים 1 גיליון קרום ניילון חיובי טעונים לאותו גודל כמו ג'ל. סמן חריץ על הג'ל ואת הקרום כסמן כדי להבטיח את הכיוון הנכון. משרים את הממברנה חיץ 2x SSC במשך 15 דקות. יוצקים 500 מ"ל of 10x SSC חיץ למגש ההעברה. הנח את גיליון נייר סינון גדול על פני הצלחת זכוכית להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה. מרדד כל בועות עם טפטפת. משרי 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך חיץ העברה ומניח אותם על המרכז של נייר הסינון משלב 2.4.5. הסר את כל בועות. הנח את הדף בצד ג'ל למטה על נייר הסינון. הנח את קרום על גבי הג'ל. ישר את החריצים של הג'ל ואת הממברנה. מניחים 2 חתיכות של נייר סינון מראש לחתוך על גבי הממברנה ואת להרטיב את נייר הסינון עם חיץ העברה. הסר את כל בועות בין השכבות. החל בניילון סביב הג'ל על מנת להבטיח כי רק מגבה לספוג חיץ עובר דרך ג'ל הממברנה. סטאק את מגבות נייר על גבי נייר הסינון. מניח צלחת זכוכית גדולה על גבי המגבות. מניחים משקל על החלק העליון של הערימה. שמור לילה לאפשר RNA להעביר מן הג'ל על הממברנה. 3. איתור של N 6 -methyladenosine ממברנה Crosslinking שמור את קרום לחת חיץ 2x SSC. מניחים 2 גיליונות נייר מסנן שקוע עם 10x חיץ SSC לתוך crosslinker UV. מניחים את קרום על גבי נייר הסינון, כשהצד RNA-adsorbed פונה כלפי מעלה. בחר "מצב autocrosslink" (120,000 μJ) ולחץ על כפתור "התחל" כדי להתחיל את ההקרנה. בדוק את הממברנה ואת ג'ל עם לוכד תמונה ג'ל UV כדי לאשר את העברת RNA מן הג'ל על הממברנה. immunoblotting חסום את הממברנה ב 5% חלב דל שומן מלוחים טריס שנאגרו עם 20 Tween (TBST) חיץ בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לשטוף שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. דגירה הממברנה לילה מ 6 (<em> N 6 פתרון נוגדנים -methyladenosine) (1: 1,000 ב 5% דל שומן חיץ חלב TBST) ב 4 ° C.. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. דגירה הממברנה ב HRP-מצומדות חמור פתרון נוגדנים נגד ארנב (1: חיץ 2,000 5% דל שומן חלב TBST) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם חיץ TBST במשך 15 דקות. החל את המצע chemiluminescent משופרת (0.125 מ"ל לס"מ 2 של קרום). ללכוד את chemiluminescence עם ההגדרות האופטימליות של תרמי הדיגיטלי, על פי הוראות יצרן 26. מ 6 כימות למדוד את עוצמת chemiluminescent היחסית מ 6 באמצעות תוכנת ImageJ. בתפריט התוכנה ImageJ, בחר באפשרות "קובץ" כדי לפתוח את הקובץ הרלוונטי. בחר באפשרות "מלבן" מ ImageJ ולצייר על ידי מסגרת סביבאת האותות. אם RNA ריבוזומלי הוא לא המוקד של ניסויים, להימנע להקות ריבוזומלי 18S ו -28 RNA מ 6 לחישוב. לחץ על "פיקוד" ו "1" כדי לאשר את השביל שנבחר. לחץ "פיקוד" ו "3" כדי להראות את העלילה שנבחרה. לחץ על הכלי "ישר" לצייר קווים כדי להפריד את האזור המפולח. לחץ על הכלי "שרביט" כדי לרשום את המידות. לייצא את הנתונים. לנרמל את רמות א מ 6 עם להקת RNA ריבוזומלי 18S מן המכתים ברומיד ethidium.

Representative Results

לאחר 14 ימים בשלב יממה רגיל-כהה אור, עכברי wild-type הונחו בחשכה מתמדת. RNAs מהכבד נדגמו ב 4 במרווחים hr ולמד עם סופג הצפוני שונה. מתילציה של rRNAs, mRNAs, ו RNA הקטן התגלתה בבירור (איור 2). ההשוואה בין זמני יממה שונים (CT) ניתן לחשב במדויק עם תקן 18S rRNA. הייתה תנודת יממה חזקה של רמות מ 6 ב rRNA, mRNA, ו RNA הקטן. כדי למנוע את ההפרעה שהוצעה על ידי rRNA, RNAs polyadenylated יכול להיות מטוהר, כמו בשלב 1.2.2. לאחר הטיהור, rRNA ניתן למנוע במידה רבה, כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של RNAs האחר (איור 3). <stron g> איור 1: רכבת יחידת העברת כתם. יחידת העברת נימים עבור סופג את הרנ"א על ​​הקרום מוצגת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: קצב היממה של בחינות הבגרות מ 6 ב C57BL / 6J. נתון זה מראה את מ 6 כתם של RNA הכולל כבדים עכברי-בר הקריב ביום הראשון של השלב הכהה כהה לאחר 14 ימים של שלב אור כהה רגיל ב 4 במרווחי h. כימות נעשה באמצעות מ 6 הפרש צפיפות התמונה בין 18S ו -28 rRNA. מ '6 שפע היה מנורמל הלהקה 18S rRNA מן הג'ל פורמלדהיד בתחתית.et = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: כתמי הקלע זרק 6 עם או בלי rRNA. כתמי נציג מ 6 א 'של רנ"א הכל ו- RNA polyadenylated מן הכבדים של עכברי-בר מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 1 חיץ 10x מגבים (pH 7.0, להגן מפני אור) מגבים 41.85 g 0.2 M אצטט נתרן 4.1 g 0.05 מ ' EDTA, Disodium מלח 3.7 g 0.01 M מי DEPC סה"כ 1 L מערבבים בטמפרטורת החדר 2 20x חיץ SSC (pH 7.0) נתרן כלורי 175.3 g 3 M ציטראט Trisodium 88.3 g 0.3 M מי DEPC סה"כ 1 L </td> מערבבים בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי 3 דיי מעקב חיץ 10x מגבים 500 μL 1x Ficoll 400 0.75 g 15% bromophenol כחול 0.01 g 0.2% קסילן Cyanol 0.01 g 0.2% מי DEPC סה"כ 5 מ"ל חנות ב -20 ° C 4 מי DEPC לדלל יחס של 1: 1,000 של DEPC DDH 2 O מערבבים למשך הלילה בטמפרטורת החדר, ואז החיטוי 5 חיץ מדגם (להגן מפני אור) חיץ 10x מגבים 200 μL 37% פורמלדהיד 270 μL Formamide 660 μL חנות ב -20 ° C </tbody> טבלה 1: חוצצים ופתרונות.

Discussion

Modifications of RNA have important roles in cellular function and physiology. The current understanding of the regulation, function, and homeostasis of these modifications is still being explored and expanded⁸. Therefore, a precise and gold-standard method to evaluate the modifications of RNA is needed. The modified northern blotting method provides precise quantification of RNA modifications and clear delineation of the modifications in diverse RNAs. Although the method requires at least 3 days, it can be standardized and can be used in various experimental designs. Moreover, with different antibodies, it can detect different RNA modifications²⁷.

It is important to separate different RNAs when analyzing RNA modifications. Ribosomal RNA comprises a large portion of the total amount of RNA^28,29. The results from analyzing RNA modifications only in total RNA will represent mostly the changes of rRNA. Methylation and other such modifications of rRNA could potentially mask the changes in other RNAs. With the procedure of gel separation, the modifications of mRNA and other small RNAs can be more accurately analyzed.

Transcriptome-wide mapping with m⁶A immunoprecipitation and sequencing provides detailed insight into the modification of each type of RNA²². It provides information on the specific RNAs and a resolution of around 80-120 bp. Although m⁶A-Seq can compare the modifications between different experimental conditions, the selection of proper standards and controls for such experiments is difficult¹⁸. Immunoprecipitation is difficult to reproduce, often giving significant variations amongst repeats. Moreover, m⁶A-Seq requires the fragmentation of RNA samples before immunoprecipitation and sequencing³⁰. The fragmentation process could potentially induce undue influences on the original RNA modifications. If the experiment does not need the specific gene’s information but requires different conditions for comparison, the current method provides better visualization and control for diverse experimental setups.

Modification of RNA is an important step in regulating transcriptional control³¹. However, the homeostasis and the regulatory mechanisms of various RNA modifications under diverse physiological realms are still unclear. Using the present modified northern blotting method, different RNA modifications can be quantified and compared. Furthermore, the changes and regulations of RNA modifications can be investigated in greater detail. In the future, it could also be possible to combine the experimental data from both the classical northern blotting and the modified northern blotting protocols, providing greater insights into RNA biology.

The most important factor determining the success of the modified northern blotting protocol is the integrity of the RNA sample. RNAs with some amount of degradation may yield good classical northern blotting results, but this could potentially have significant impact on the modified northern blotting results. The modifications of RNA in different tissues or cell lines could also vary significantly. It is important to test the suitable RNA sample loads for different tissues before performing the final experiments.

As blotting procedures have been traditionally named after Dr. Southern and different geographical directions, we propose the name “northeastern” blotting for the current technique.

Materials

RNaseZap solution	Ambion	AM9782	Protocol 1.1
TRI Reagent solution	Ambion	AM9738	Protocol 1.2.1.1
1-Bromo-3-chloropropane (BCP)	Sigma	B9673	Protocol 1.2.1.3
Ethanol	JTbaker	8006	Protocol 1.2.1.3
Isopropanol	Sigma	I9516	Protocol 1.2.1.3
GenElute mRNA Miniprep Kit	Sigma	MRN70	Protocol 1.2.2.1
Glycogen	Ambion	AM9510	Protocol 1.2.2.2
Sodium acetate	Fluka	71183	Protocol 1.2.2.2
Nuclease-free water	Ambion	AM9930	Protocol 1.2.2.6
DEPC	Sigma	D5758	Protocol 2.1.1
Agarose	JT Baker	A426	Protocol 2.1.2
MOPS	Sigma	M1254	Protocol 2.1.3
37% formaldehyde Solution	Sigma	F8775	Protocol 2.1.3
EDTA, Disodium Salt	JT Baker	8993	Protocol 2.1.3 10X MOPS buffer
formamide	Sigma	F7503	Protocol 2.2.1
RNA Millennium Marker	Ambion	AM7150	Protocol 2.2.2
Ethidium Bromide	Amresco	X328	Protocol 2.2.5
Ficoll 400	GE Healthcare	17-0300-10	Protocol 2.2.5 tracking dye
Bromophenol blue	Sigma	114391	Protocol 2.2.5 tracking dye
Xylene Cyanol	Sigma	X4126	Protocol 2.2.5 tracking dye
Sodium chloride	JT Baker	3624	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
Trisodium citrate	Sigma	S1804	Protocol 2.4.2 20X SSC buffer
filter paper	GE Healthcare	RPN6101M	Protocol 2.4.4
GE Hybond-N+ membrane	GE Healthcare	RPN303B	Protocol 2.4.6
Stratalinker UV Crosslinker 2400	Stratagene	400075	Protocol 3.1.2
Gel Catcher 1500	ANT Technology	Gel Catcher 1500	Protocol 3.1.5
Anti-m6A (N6-methyladenosine)	Synaptic Systems	202003	Protocol 3.2.3
Amersham ECL Anti-Rabbit IgG, HRP-linkd whole Ab	GE Healthcare	NA934	Protocol 3.2.5
ChemiDoc MP System	BIO-RAD	1708280	Protocol 3.2.8