Met behulp van RNA-sequencing te detecteren Novel Splice varianten Gerelateerd aan Drug Resistance in<em> In Vitro</em> Cancer Models
Summary
Hier beschrijven we een protocol gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splicing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van de ouders en bestand in vitro modellen door middel van RNA-seq en vestigde een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren.
Abstract
Geneesmiddelenresistentie blijft een groot probleem in de behandeling van kanker voor zowel hematologische maligniteiten en vaste tumoren. Intrinsiek of verworven resistentie kan worden veroorzaakt door een aantal mechanismen, waaronder verhoogde eliminatie van het geneesmiddel, verminderde geneesmiddelopname, drug inactivatie en veranderingen van drug targets. Recente gegevens toonden aan dat anders dan door bekende genetische (mutatie, versterking) en epigenetische (DNA Hypermethylering, histone post-translationele modificatie) modificaties, resistentie tegen geneesmiddelen mechanismen kan ook worden gereguleerd door splicing aberraties. Dit is een snel groeiend gebied van onderzoek dat toekomstige aandacht om meer effectieve therapeutische benaderingen plannen verdient. De in dit document beschreven protocol is gericht op onderzoek naar de gevolgen van afwijkende splitsing op resistentie in solide tumoren en hematologische maligniteiten. Om dit doel te bereiken, analyseerden we het transcriptoom profielen van verschillende in vitro modellen door middel van RNA-seq en stellened een qRT-PCR-methode om kandidaatgenen te valideren. In het bijzonder, evalueerden we de differentiële splicing van DDX5 en PKM transcripties. De afwijkende splitsing gedetecteerd door de rekenkundige functie MATS werd gevalideerd in leukemische cellen, wat aantoont dat verschillende DDX5 splice varianten zijn tot expressie gebracht in de ouderlijke vs. resistente cellen. In deze cellen zagen we ook meer PKM2 / PKM1 verhouding, die niet werd gedetecteerd in de Panc-1 gemcitabine-resistente tegenhanger in vergelijking met ouderlijke Panc-1-cellen, suggereert een ander mechanisme van resistentie geïnduceerd door blootstelling gemcitabine.
Introduction
Ondanks aanzienlijke vooruitgang in de behandeling van kanker, resistentie van kwaadaardige cellen voor chemotherapie, intrinsiek of bij langdurige blootstelling aan het geneesmiddel verkregen, is de belangrijkste oorzaak van falen van de behandeling in een breed scala van leukemie en vaste tumoren 1.
Om de onderliggende mechanismen resistentie, in vitro cellijn modellen bakenen ontwikkeld door stapsgewijze selectie van kankercellen resistent zijn tegen chemotherapeutica. Deze procedure bootst de regimes worden gebruikt in de klinische settings en maakt daarom een diepgaand onderzoek van de relevante mechanismen weerstand. Resistente cellen die de behandeling overleven worden vervolgens uit ouderlijke gevoelige cellen gekenmerkt met cellevensvatbaarheid / cytotoxiciteitassays 2. In vitro resistentie profielen van primaire cellen bleken significant gerelateerd aan klinische respons op chemotherapie 3 te zijn.
High-throughput cytotoxiciteit testen vormen een geschikte methode om geneesmiddelgevoeligheid in vitro bepalen. Hierin wordt de levensvatbaarheid van de cellen beoordeeld door bijvoorbeeld de 3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromide – MTT assay 4, die is gebaseerd op de metabole omzetting van bepaalde substraten (dwz tetrazoliumzouten) in gekleurde producten, waardoor de mitochondriale activiteit van cellen weerspiegelt. Als alternatief kan de cellulaire eiwitten worden gekwantificeerd met behulp van de sulforhodamine B (SRB) test 5. Hier is het aantal levensvatbare cellen is evenredig met de optische dichtheid (OD) gemeten bij een geschikte golflengte in een spectrofotometer, zonder behoefte uitgebreide en tijdrovende procedures celtellingen. De groeiremming veroorzaakt door een bepaald chemotherapeutisch geneesmiddel kan worden berekend op basis van de buitendiameter van de putjes die cellen werden behandeld met een testmiddel en vergeleken met de OD van onbehandelde controlecellen. Een dosis-response curve OBTAined door het uitzetten geneesmiddelconcentratie versus percentage levensvatbare cellen ten opzichte van controle cellen. Tenslotte kan geneesmiddelgevoeligheid worden gerapporteerd als de concentratie die resulteert in 50% van de celgroei remming vergeleken met onbehandelde cellen (IC 50).
De onderliggende mechanismen geneesmiddelresistentie omvatten vele verschillende afwijkingen zoals veranderingen beïnvloeden genexpressie determinanten medicijnactiviteit en cellulaire metabolisme. Deze moleculaire laesies, met inbegrip van mutaties, afwijkingen bij een transcriptionele en post-transcriptionele niveau als gestoorde epigenetische regulatie vaak van invloed op genen die betrokken zijn, hetzij in het metabolisme van geneesmiddelen of apoptose 6.
Alternatieve pre-mRNA splicing en zijn ingewikkelde regelgeving hebben onlangs veel aandacht als een nieuwe entiteit die geneesmiddelen resistentie van kankercellen 7 kan dicteren. Tot 95% van de menselijke genen alternatief gesplitste in normale cellen door middel van dezestrak gereguleerd proces waarbij verschillende isovormen eiwit produceert uit hetzelfde gen. Alternatieve splicing is vaak gedereguleerd bij kanker en verscheidene tumoren worden gekenmerkt door veranderde splicing van steeds meer genen betrokken bij geneesmiddelmetabolisme (dwz desoxycytidinekinase, folylpolyglutamaat synthetase of Multidrug resistentie eiwitten) 6,8. Echter, uitgebreide analyse van splicing profielen van geneesmiddelen resistente cellen pijnlijk ontbreekt. Daarom is het noodzakelijk om hoge doorvoer werkwijzen voor alternatieve splicing analyse ontwikkelen. Dit zou kunnen helpen om meer effectieve therapeutische benaderingen te ontwikkelen.
Tijdens het laatste decennium heeft de snelle ontwikkeling van de volgende generatie sequencing (NGS) technologieën voor biomedisch onderzoek met nieuwe inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag regulatie van het genoom meningsuiting en hun rol in verschillende biologische processen 9 verrijkt. RNA-sequencing (RNA-seq) is een krachtige sub-applicatievan NGS op het gebied van transcriptomics. Het kan een genoom-brede profilering (kwalitatief en kwantitatief) van de expressiepatronen van duizenden genen tegelijkertijd is zeer geschikt voor de karakterisering van nieuwe coderende mRNAs als lange niet-coderende RNA, miRNA, siRNA en andere kleine RNA klassen (bijv snRNA en Pirna) 10,11.
RNA-Seq heeft vele voordelen ten opzichte van eerdere technieken voor transcriptoom karakterisering (bijvoorbeeld Sanger sequentiebepaling en expressie microarrays). Het is niet gebaseerd op bestaande genoomannotatie, het heeft een enkele nucleotide resolutieniveau en een breder dynamisch bereik voor expressieniveau schatting. In het kort, de basis experimentele workflow van RNA-seq experimenten bestaat uit gepolyadenyleerd transcript (mRNA) selectie en fragmentatie, gevolgd door omzetting in cDNA, bibliotheek bouw en ten slotte, massaal parallelle deep sequencing 12,13. Door snelle daling van sequencinkosten g in de afgelopen jaren, RNA-seq wordt geleidelijk vervangen door andere technologieën en aanzienlijke inspanningen worden gedaan om de bibliotheek voorbereiding protocollen te verbeteren. Zo is het mogelijk om de streng informatie van mRNA transcripten behouden door het markeren van de tweede cDNA-streng met deoxyuridine trifosfaat (dUTP) en voorafgaand aan PCR amplificatie, digereren de gemerkte streng met uracil-DNA-glycosilase (UDG). Dit proces verbetert de nauwkeurigheid van gen-annotatie en de schatting van de expressie levels 14,15.
Het analyseren en interpreteren van RNA-seq data vereisen complexe en krachtige computationele softwarepakketten en verwerking in bioinformatica pijpleidingen 16,17. Ten eerste, de rauwe leest kwaliteitscontrole ondergaan door het wegnemen van technische en biologische artefacten en weggooien (trimmen) de sequenties die geen strenge kwaliteitseisen niet bereiken. Vervolgens wordt het bed voor elk monster worden toegewezen aan een referentie genoom en geïndexeerdin gen-niveau, exon-niveau of transcript niveau, teneinde de overvloed van elke categorie bepalen. Afhankelijk van de toepassing, zijn verfijnde data vervolgens berekend door middel van statistische modellen voor de identificatie van allel-specifieke expressie, alternatieve splicing, gen fusies en single nucleotide polymorphisms (SNPs) 12. Ten slotte kan differentiële analyses op geselecteerde niveau (dat wil zeggen, genexpressie of alternatieve splicing) worden gebruikt om monsters die onder verschillende omstandigheden te vergelijken.
Differentiële splicing analyse beschrijft de verschillen in splice gebruik van de site tussen de twee monsters. Steeds softwarepakketten is voor dit doel zijn gebaseerd op verschillende statistische modellen, uitvoeringen en gebruikersinterface 18. Onder deze, MATS (Multivariate analyse van Transcript verbinden) naar voren als een vrij beschikbaar en precieze computational tool gebaseerd op een Bayesian statistische kader en ontworpen om diffe detecterenrential splicing gebeurtenissen uit enkele of gepaarde end RNA-seq data. Vanaf de uitgelijnde (.bam) bestanden, kan MATS detecteren alle belangrijke types van alternatieve splicing gebeurtenissen (exon skipping, alternatieve 3'-splitsingsplaats, alternatieve 5'-splitsingsplaats, elkaar uitsluitende exons en retentie intron – zie ook figuur 1).
Ten eerste, de software identificeert leest die een zekere verbinding gebeurtenis, bij voorbeeld exon skipping en classificeert ze in twee types. "Inclusion leest" (voor de canonieke splice event) kaart binnen de onderzochte exon en span de verbindingen tussen die specifiek exon en de twee upstream en downstream flankerende exonen. "Skipping leest" (voor de alternatieve splice event) overspannen de kruising tussen de twee flankerende exonen. Vervolgens MATS geeft de genormaliseerde opname niveau voor zowel de canonieke en alternatieve evenementen en vergelijkt waarden tussen de monsters of voorwaarden. Uiteindelijk berekent P-waarde and valse ontdekking rate (FDR) aangenomen dat het verschil in de verhouding variant van een gen tussen twee voorwaarden een bepaalde door de gebruiker gedefinieerde drempel voor elke splitsing gebeurtenis 19,34 overschrijdt.
Naar aanleiding van differentiële splicing analyse in combinatie met RNA-seq, is een uitgebreide experimentele validatie gerechtvaardigd om true-positieve kandidaten 18 gen te identificeren. Kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase ketenreactie (qRT-PCR) is de meest gebruikte en optimale methode validatie kandidaten verkregen uit RNA-Seq analyse 20. Het doel van dit artikel is om een robuuste methodologie om resistentie gerelateerde splicing profielen in solide tumoren en hematologische maligniteiten onderzoeken bieden. Onze aanpak maakt gebruik van RNA-seq-gebaseerde transcriptoom profilering van geselecteerde cellijn modellen van resistente vormen van kanker in combinatie met een gevestigde qRT-PCR-methode voor de validatie van kandidaat-genen betrokken bij resistentie tegen geneesmiddelen.
<p class = "jove_content"> De humane leukemie cellijn modellen die in deze studie werden pediatrische T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL) cellijn CCRF-CEM (CEM-WT), de twee glucocorticoïden (GC) resistente subklonen CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) en CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 en de methotrexaat (MTX) resistente sublijn CEM / R30dm 23. Hoewel de huidige therapieën op basis van GC en MTX vestigen klinisch voordeel bij ongeveer 90% van de gevallen, de opkomst van GC-resistentie vormt nog steeds een onopgelost probleem met een onduidelijke moleculaire mechanisme. GC-resistente subklonen isoleren CEM-WT cellen werden gekweekt in 1 uM dexamethason (Dex) gedurende 2 tot 3 weken. MTX-resistente sublijn CEM / R30dm werd ontwikkeld door middel van herhaalde korte termijn (24 uur) blootstelling van CEM-WT-cellen tot 30 uM MTX als een nabootsing van de klinische protocollen. Interessant is weergegeven deze cellijn ook kruisresistentie Dex (niet gepubliceerde resultaten) waarvoor het mechanisme niet volledig begrepen.De vaste tumof model onderzocht in deze studie is de pancreas ductaal adenocarcinoom, berucht om zijn buitengewone ongevoeligheid voor chemotherapie. Daartoe selecteerden we Panc-1 cellijn en gemcitabine-resistente subkloon Panc-1R verkregen door continue incubatie met 1 uM van het geneesmiddel 24. Hier beschrijven we een benadering om nieuwe onderliggende mechanismen in vitro geneesmiddelresistentie ontdekken combineert drie protocollen: colorimetrische cytotoxiciteit assays geneesmiddelgevoeligheid in leukemische cellen en kankercellen van solide tumoren, RNA-seq gebaseerde pijpleiding beoordelen op nieuwe splice-varianten met betrekking tot identificatie geneesmiddelgevoeligheid / resistentie en RT-PCR en qRT-PCR analyse potentiële kandidaten valideren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een nieuwe benadering die gevestigde cytotoxiciteit screening technieken en krachtige NGS-gebaseerde transcriptomische combineert analyses differentiële splicing gebeurtenissen te identificeren met betrekking tot resistentie tegen geneesmiddelen. Spectrofotometrische assays gemakkelijk en robuust high-throughput methoden geneesmiddelgevoeligheid in vitro kankermodellen beoordelen en vormen de eerste keuze voor veel laboratoria die cytotoxiciteit screenings. Problemen en mogelijke varianten …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
References
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
- Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
- Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
- Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
- Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
- Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
- Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
- Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
- Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
- Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
- Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
- Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
- Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
- McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
- Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
- Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
- Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
- Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
- Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
- Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
- Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
- Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
- Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).
