שימוש-רצף RNA כדי זיהוי וריאנטים אחוי Novel הקשורות עמידות לתרופות ב<em> במבחנה</em> מודלי סרטן
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול שנועד לבחון את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, נתחנו את פרופילי transcriptomic דגמים הוריים ועמידים במבחנה באמצעות RNA-seq והקמתי שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גני מועמדים.
Abstract
עמידות לתרופות נשארת אחת בעיות עיקריות לטיפול בסרטן הוא ממאירויות המטולוגיות וגידולים מוצקים. התנגדות פנימית או נרכש יכולה להיגרם על ידי מגוון של מנגנונים, כולל חיסול סמים עלה, ירד ספיגת התרופה, איון התרופה ושינויים של מטרות תרופה. נתונים אחרונים הראו כי מלבד על ידי (מוטציה, הגברה) גנטי ידוע אפיגנטיים (היפר-מתילציה DNA, שינוי שלאחר translational היסטון) שינויים, מנגנוני עמידות לתרופות עשוי גם להיות מוסדר על ידי סטיות שחבור. זהו תחום הולך וגדל במהירות של חקירה ראויה לתשומת לב בעתיד על מנת לתכנן גישות טיפוליות יעילות יותר. הפרוטוקול המתואר במאמר זה נועד על מנת לבדוק את ההשפעה של שחבור סוטה על עמידות לתרופות בגידולים מוצקים דם ממאירות. למטרה זו, ניתחנו את הפרופילים transcriptomic מכמה דגמים במבחנה באמצעות RNA-seq ולהקיםed שיטה המבוססת qRT-PCR כדי לאמת גנים מועמדים. בפרט, אנו הערכנו את שחבור ההפרש של תמלילי DDX5 ו PKM. השחבור הסוטה זוהה על ידי כלי חישובי המחצלות שקבל תוקף בתאי leukemic, מראה כי וריאנטים אחוי שונים DDX5 באים לידי ביטוי בתאים העמידים לעומת ההורים. בתאים אלה, אנחנו גם ציינו PKM2 גבוה / יחס PKM1, אשר לא זוהה עמיתו Panc-1 עמיד gemcitabine בהשוואה לתאים Panc-1 הוריים, דבר המצביע על מנגנון שונה של עמידות לתרופות מושרות על ידי חשיפת gemcitabine.
Introduction
למרות התקדמות ניכרה בטיפול בסרטן, התנגדות של תאים ממאירים לכימותרפיה, בין אם פנימי או רכש בחשיפה ממושכת בסמים, הוא הסיבה העיקרית לכישלון טיפול במגוון רחב של לוקמיה וגידולים מוצקים 1.
על מנת להתוות את המנגנונים עמידים לתרופות, במודלי שורת תאים במבחנה מפותח על ידי בחירה בשלבים של תאים סרטניים עמידים בפני תרופות כימותרפיות. הליך זה מחקה את המשטרים בשימוש במסגרות קליניות ולכן מאפשר חקירה מעמיקה של מנגנוני עמידות רלוונטי. תאים עמידים אשר לשרוד את הטיפול נבדלים אז מתאי הורים רגישים באמצעות מבחני כדאיויות תא / cytotoxicity 2. בשנת פרופילים עמידות לתרופות במבחנה של תאים ראשוניים הוכח להיות קשור באופן מובהק תגובה קלינית לכימותרפיה 3.
cytoto תפוקה גבוההמבחני xicity מהווים שיטה נוחה לקבוע רגישות לתרופה במבחנה. בזאת, את הכדאיות של תאים נבחנת על ידי למשל 3- [4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.] -2,5-diphenyl tetrazolium ברומיד – MTT assay 4, אשר מבוססת על המרה מטבולית של מצעים מסוימים (כלומר, מלחי tetrazolium) לתוך מוצרים צבעוניים, המשקפים את פעילות המיטוכונדריה של תאים. לחלופין, את תכולת החלבון הסלולר ניתן לכמת באמצעות B sulforhodamine (SRB) assay 5. כאן, מספר תאי קיימא הוא יחסי הצפיפות האופטית (OD) נמדדה באורך גל מתאים ספקטרופוטומטר, ללא צורך של נרחב ונדרש זמן רב נהלי ספירת תאים. עיכוב הצמיחה המושרה על ידי תרופת כימותרפיות מסוימת ניתן לחשב על בסיס OD של הבארות שבו תאים טופלו עם סוכן בדיקה בהשוואת OD לתאי קבוצת ביקורת. עקומת מנה-תגובה היא obtaשאינו עומד ידי התוויית ריכוז תרופה לעומת אחוזי תאי קיימא ביחס לשלוט תאים. לבסוף, רגישות התרופה ניתן כפי שדווח ריכוז שתוצאתו 50% של עיכוב צמיחת תאים לעומת בתאים שלא טופלו (IC 50).
המנגנונים עמידות לתרופות כוללים ליקויים רבים ושונים, כגון שינויים המשפיעים ביטוי גנים הקובעים פעילות התרופה ועל חילוף החומרים בתאים. נגעים מולקולריים אלה, כוללים מוטציות, סטיות בכל תעתיק ורמה שלאחר תעתיק וכן תקנה אפיגנטיים מופרעת לעתים קרובות להשפיע גנים המעורבים גם במטבוליזם תרופה או אפופטוזיס 6.
שחבור מראש mRNA אלטרנטיבי הרגולציה הסבוכה שלה קבלו תשומת לב רבה לאחרונה כישות רומן שעשוי להכתיב עמידות לתרופות של תאים סרטניים 7. עד 95% של גנים אנושיים הם שחבור חלופי תאים נורמלים באמצעות זהבחוזקה תהליך מוסדר מייצר isoforms חלבון שונה מאותו הגן. שחבור אלטרנטיבי הוא deregulated לעתים קרובות סרטן וכמה גידולים מאופיינים שחבור שונה של מספר הולך וגדל של גנים המעורבים במטבוליזם התרופה (כלומר, קינאז deoxycytidine, synthetase folylpolyglutamate, או חלבונים התנגדות multidrug) 6,8. עם זאת, ניתוח מקיף של פרופילי שחבור של תאי תרופה עמידים חסר עד כאב. לכן, קיים הכרח לפתח שיטות תפוקה גבוהות לניתוח שחבור חלופי. זה יכול לעזור לפתח גישות טיפוליות יעילות יותר.
במהלך העשור האחרון, ההתפתחות המהירה של טכנולוגיות רצף הדור הבא (NGS) העשירה מחקר ביו עם תובנות חדשות על המנגנונים המולקולריים השולטים בקרת הביטוי הגנום ותפקידם תהליכים ביולוגיים שונים 9. RNA-רצף (RNA-seq) הוא יישום משנה עוצמהשל NGS בתחום transcriptomics. היא מאפשרת יצירת פרופיל רחב של הגנום (הן מבחינה איכותית וכמותית) של דפוסי הביטוי של אלפי גנים בו זמנית הוא גם מתאים לאפיון mRNAs קידוד הרומן וכן RNA ללא קידוד ארוך, מירנה, siRNA, ו- RNA קטנים אחרים כיתות (למשל, snRNA ו Pirna) 10,11.
יש RNA-seq יתרונות רבים על פני טכנולוגיות קודמות לאפיון transcriptome (למשל, רצף סנגר ו microarrays הביטוי). הוא אינו מבוסס על ביאור הגנום קיים, הוא ברמת נוקלאוטיד יחיד של רזולוציה ויש לו טווח דינמי רחב יותר לאמידת רמת ביטוי. בקצרה, העבודה הניסיונית הבסיסית של ניסויים-seq RNA מורכבת תמליל polyadenylated (mRNA) מבחר ופיצול, ואחריו והפיכתן cDNA, בניית ספרייה ולבסוף, רצף מקביל עמוק מסיבי 12,13. בשל ירידה מהירה של sequencinעלויות גרמו במשך כמה השנים, RNA-seq האחרונים מחליפות טכנולוגיות אחרות בהדרגת מאמצים משמעותיים נעשים כדי לשפר את הפרוטוקולים כני ספרייה. לדוגמה, ניתן כיום כדי לשמור את המידע קווצת תעתיקי mRNA על ידי סימון cDNA גדיל השני עם אדנוזין deoxyuridine (dUTP) ו, לפני PCR הגברה, לעכל את גדיל המסומנות אורציל-DNA-glycosilase (UDG). תהליך זה משפר את הדיוק של ביאור גן ואמידה של רמות ביטוי 14,15.
הניתוח ופרשנות של נתונים seq-RNA דורשים חבילות תוכנה חישובית מורכבת ורבת עוצמה ועיבוד בתוך צינורות bioinformatic 16,17. ראשית, גלם קורא עובר בקרת איכות על ידי הסרת חפצים טכניים וביולוגיים והשלכת (זמירה) הרצפים אשר אינו מגיעים דרישות איכות מחמירות. החל מאותו מועד, קורא עבור כל דגימה ממופים הגנום התייחסות באינדקסאל-רמת גן, אקסון-רמה, או ברמת תעתיק, על מנת לקבוע את השפע של כל קטגוריה. בהתאם ליישום, נתונים מעודנים אז מחושבים באמצעות מודלים סטטיסטיים לזיהוי ביטוי אלל הספציפי, השחבור חלופי, בשילובי גני פולימורפיזם נוקלאוטיד בודד (SNPs) 12. לבסוף, ניתוח ההפרש על הרמה הנבחרת (כלומר, ביטוי גנים או שחבור חלופי) שניתן להשתמש בהם כדי להשוות דגימות שהתקבלו בתנאים שונים.
ניתוח שחבור הפרש מתאר בדלי שימוש באתר אחוי בין שתי דגימות. מספר גדל והולך של חבילות תוכנה מוקדשות למטרה זו זמין על בסיס מודלים סטטיסטיים שונים, הופעות ממשק משתמש 18. בין אלה, מחצלות (ניתוח רב המשתנה של תמליל שחבור) מתגלות ככלי חישובית בחופשיות זמין ומדויק המבוסס על מסגרת סטטיסטית בייס ו נועדו לזהות diffeאירועי שחבור rential מנתונים סוף יחיד או זיווג או seq-RNA. החל מ הקבצים (.bam) המיושרים, מחצלות יכולות לזהות את כל הסוגים העיקריים של אירועי שחבור חלופיים (דילוג אקסון, 3 חלופי "אתר שחבור, 5 חלופי" אחוי באתר, אקסונים ושימור אינטרון סותרים – גם ראו איור 1).
ראשית, מזדהה התוכנה קוראת התומכים אירוע אחוי מסוים, מדלגי אקסון למשל, ומסווג אותן לשני סוגים. "הכללה קוראת" (עבור אירוע אחוי הקנונית) למפות בתוך אקסון חקר span צומת בין כי אקסון ספציפי שני אקסונים האיגוף במעלה או במורד זרם. "דילוג קורא" (עבור האירוע אחוי החלופי) משתרע על פני הצומת בין שני אקסונים האיגוף. בהמשך לכך, מחצלות מחזירות את רמת ההכללה המנורמלת עבור שני האירועים הקנונית ואלטרנטיביים ומשווות ערכים בין דגימות או תנאים. בסופו של דבר, היא מחשבת P-ערך nd שיעור תגליות שגוי (FDR) בהנחה כי הבדל היחס וריאנט של גן בין שני תנאים עובר סף המוגדר על ידי משתמש שניתן עבור כל אירוע שחבור 19,34.
בעקבות ניתוח שחבור הפרש בשיתוף עם-seq RNA, אימות ניסיון נרחבת היא מוצדקת כדי לזהות מועמדי גן נכונים חיוביים 18. הפכו כמוני תגובת השרשרת עבד-פולימראז (qRT-PCR) היא השיטה הנפוצה ביותר ואופטימלית באימות של מועמדים המתקבלים מניתוח RNA-seq 20. מטרת מאמר זה היא לספק מתודולוגיה חזק כדי לחקור פרופילי שחבור הקשורה לסמי התנגדות בגידולים מוצקים דם ממאירות. הגישה שלנו מנצלת פרופיל transcriptome מבוסס RNA-seq של מודלי קו התא נבחרים של סרטן עמיד לתרופות בשילוב עם שיטת qRT-PCR הוקמה עבור האימות של גני המועמדים מעורבים עמידות לתרופות.
<p class = "jove_content"> המודלים שורת תאים לוקמיה השתמשו במחקר זה כללו לוקמיה לימפובלסטית חריפה T-cell ילדים (T-ALL) תא קו CCRF-CEM (CEM-WT), שני שלה בסטרואידים (GC) -resistant subclones CEM -C7H2-R5C3 (CEM-C3) ו CEM-C7R5 (CEM-R5) 21,22 ואת methotrexate (MTX) -resistant SubLine CEM / R30dm 23. למרות הטיפולים הקיימים כיום מבוססים על GCS ו MTX להקים תועלת קלינית בכ- 90% מהמקרים, את הופעתה של עמידות GC עדיין מהווה בעיה לא פתורה עם מנגנון מולקולרי ברור. GC-עמיד תת-שיבוטים כדי לבודד, CEM-WT התאים היו בתרבית 1 dexamethasone מיקרומטר (דקס) עבור 2 עד 3 שבועות. MTX העמיד SubLine CEM / R30dm פותח באמצעות לזמן קצר חזר (24 שעות) חשיפה של תאי CEM-WT 30 מיקרומטר MTX כמו חקיין של פרוטוקולים קליניים. מעניין, את שורות תאים גם מוצגות עמידות צולבת דקס (תוצאות לא פורסמו) עבורו המנגנון לא מובנת לחלוטין.Tum המוצקאו מודל נחקר במסגרת המחקר הנוכחי הוא אדנוקרצינומה ductal לבלב, לשמצת עמידותו בפני חום גבוה יוצא דופן לכימותרפיה. לשם כך, בחרנו Panc-1 תאים קו-השיבוט תת gemcitabine העמיד שלה Panc-1R מתקבל על ידי דגירה רציפה עם 1 מיקרומטר של התרופה 24. כאן אנו מתארים גישה לגלות מנגנוני הרומן שבבסיס חוץ גופית עמידות לתרופות ידי שילוב שלושה פרוטוקולים: מבחני רעילות colorimetric להעריך רגישות התרופה בתאים leukemic ותאי סרטן מגידולים מוצקים, RNA-seq מבוססי צינור לזהות וריאנטים אחוי הרומן הקשורים רגישות / עמידות לתרופות ו RT-PCR וניתוח qRT-PCR כדי לאמת מועמדים פוטנציאליים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים גישה חדשנית המשלבת טכניקות הקרנת cytotoxicity ומבוססות transcriptomic NGS החזק המבוססים מנתח לזהות אירועי שחבור הפרש ביחס עמידות לתרופות. מבחני spectrophotometric שיטות נוחות ויציבות תפוקה גבוהה כדי להעריך רגישות תרופה במודלי סרטן במבחנה ולייצג את הבחירה הראשונה למעב…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge prof. J.J. McGuire, prof. R. Kofler and dr. K. Quint for providing the resistant cell lines used in this work. The study has been founded by grants from Cancer Center Amsterdam (CCA) Foundation (to JC, EG and RS), the KiKa (Children Cancer-free grant for AW) foundation, the Law Offices of Peter G. Angelos Grant from the Mesothelioma Applied Research Foundation (to VEG and EG), Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC), Istituto Toscano Tumori (ITT), and Regione Toscana Bando FAS Salute (to EG).
Materials
| Sulforhodamine B | Sigma-Aldrich | 230162 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | 251399 | |
| CCRF-CEM | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CCL-119 | |
| Panc-1 | ATCC, Manassas, VA, USA | ATCC CRL-1469 | |
| DMEM high glucose | Lonza, Basel, Switzerland | 12-604F | |
| RPMI-1640 | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 11875093 | |
| Fetal bovine and calf serum | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 758093 | |
| penicillin G streptomycin sulphate | Gibco, Carlsbad, CA, USA | 15140122 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Sigma Aldrich | 252859 | |
| MTT formazan | Sigma Aldrich | M2003 | |
| Anthos-Elisa-reader 2001 | Labtec, Heerhugowaard, Netherlands | UV-Vis 96-well plate spectrophotometer | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Greiner/Sigma | M0812-100EA | |
| Trypsin/EDTA Solution 100 ml | Lonza, Basel, Switzerland | CC-5012 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82051-074 | |
| CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 82050-856 | |
| Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) | B.Braun Melsungen AG, Germany | 362 3140 |
References
- Gottesman, M. M. Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med. 53, 615-627 (2002).
- McDermott, M., et al. In vitro Development of Chemotherapy and Targeted Therapy Drug-Resistant Cancer Cell Lines: A Practical Guide with Case Studies. Front Oncol. 4, 40 (2014).
- Kaspers, G. J., et al. Prednisolone resistance in childhood acute lymphoblastic leukemia: vitro-vivo correlations and cross-resistance to other drugs. Blood. (1), 259-266 (1998).
- van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 731, 237-245 (2011).
- Vichai, V., Kirtikara, K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening. Nat Protoc. 1 (3), 1112-1116 (2006).
- Wojtuszkiewicz, A., Assaraf, Y. G., Maas, M. J., Kaspers, G. J., Jansen, G., Cloos, J. Pre-mRNA splicing in cancer: the relevance in oncogenesis, treatment and drug resistance. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5, 673-689 (2015).
- Liu, S., Cheng, C. Alternative RNA splicing and cancer. Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (5), 547-566 (2013).
- Wojtuszkiewicz, A., et al. Folylpolyglutamate synthetase splicing alterations in acute lymphoblastic leukemia are provoked by methotrexate and other chemotherapeutics and mediate chemoresistance. Int J Cancer. 138 (7), 1645-1656 (2016).
- Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 10, 1135-1145 (2008).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 1, 57-63 (2009).
- Ozsolak, F., Milos, P. M. RNA sequencing: advances, challenges and opportunities. Nat Rev Genet. 2, 87-98 (2011).
- Han, Y., Gao, S., Muegge, K., Zhang, W., Zhou, B. Advanced Applications of RNA Sequencing and Challenges. Bioinform Biol Insights. 9 (Suppl 1), 29-46 (2015).
- Khatoon, Z., Figler, B., Zhang, H., Cheng, F. Introduction to RNA-Seq and its applications to drug discovery and development. Drug Dev Res. 5, 324-330 (2014).
- Zhao, S., et al. Comparison of stranded and non-stranded RNAseq transcriptome profiling and investigation of gene overlap. BMC Genomics. 16, 675 (2015).
- Carrara, M., et al. Alternative splicing detection workflow needs a careful combination of sample prep and bioinformatics analysis. BMC Bioinformatics. 16 (Suppl 9), (2015).
- Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).
- Wang, L., Wang, S., Li, W. RSeQC: quality control of RNA-seq experiments. Bioinformatics. 28, 2184-2185 (2012).
- Hooper, J. E. A survey of software for genome-wide discovery of differential splicing in RNA-Seq data. Hum Genomics. 8, (2014).
- Shen, S., et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data. Nucleic Acids Res. 8, e61 (2012).
- Vargas, I. M., Vivas-Mejìa, P. E. Assessment of mRNA splice variants by qRT-PCR. Methods Mol Biol. 1049, 171-186 (2013).
- Hala, M., Hartmann, B. L., Böck, G., Geley, S., Kofler, R. Glucocorticoid-receptor-gene defects and resistance to glucocorticoid-induced apoptosis in human leukemic cell lines. Int J Cancer. 68 (5), 663-668 (1996).
- Schmidt, S., et al. Glucocorticoid resistance in two key models of acute lymphoblastic leukemia occurs at the level of theglucocorticoid receptor. FASEB J. 20 (14), 2600-2602 (2006).
- McCloskey, D. E., McGuire, J. J., Russell, C. A., Rowan, B. G., Bertino, J. R., Giuseppe Pizzorno, G., et al. Decreased folylpolyglutamate synthetase activity as a mechanism of methotrexate resistance in CCRF-CEM human leukemia sublines. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6181-6187 (1991).
- Quint, K., et al. Pancreatic cancer cells surviving gemcitabine treatment express markers of stem cell differentiation and epithelial-mesenchymal transition. Int J Oncol. 41 (6), 2093-2102 (2012).
- Lin, S., et al. DDX5 is a positive regulator of oncogenic NOTCH1 signaling in T cell acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 32 (40), 4845-4853 (2013).
- Mazurek, A., et al. Acquired dependence of acute myeloid leukemia on the DEAD-box RNA helicase DDX5. Cell Rep. 7 (6), 1887-1899 (2014).
- Calabretta, S., et al. Modulation of PKM alternative splicing by PTBP1 promotes gemcitabine resistance in pancreatic cancer cells. Oncogene. , (2016).
- Azoitei, N., et al. PKM2 promotes tumor angiogenesis by regulating HIF-1α through NF-κB activation. Mol Cancer. 15 (1), (2016).
- Samuels, A. L., Heng, J. Y., Beesley, A. H., Kees, U. R. Bioenergetic modulation overcomes glucocorticoid resistance in T-lineage acute lymphoblastic leukaemia. Br J Haematol. 165 (1), 57-66 (2014).
- Rots, M. G., Pieters, R., Kaspers, G. J., Veerman, A. J., Peters, G. J., Jansen, G. Classification of ex vivo methotrexate resistance in acute lymphoblastic and myeloid leukaemia. Br J Haematol. 110 (4), 791-800 (2000).
- Funel, N., et al. Laser microdissection and primary cell cultures improve pharmacogenetic analysis in pancreatic adenocarcinoma. Lab Invest. 88 (7), 773-784 (2008).
- Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18708-18713 (2011).
- Kole, R., Krainer, A. R., Altman, S. RNA therapeutics: beyond RNA interference and antisense oligonucleotides. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 125-140 (2012).
- Shen, S., et al. rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), E5593-E5601 (2014).
