hypergepolariseerde¹³ C Metabolic magnetische resonantie spectroscopie en beeldvorming

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

In de afgelopen decennia, nieuwe methoden voor tumor staging, restaging, de behandeling respons monitoring, en herhaling detectie van een verscheidenheid van kanker naar voren zijn gekomen in samenwerking met de positron emissie tomografie state-of-the-art met ¹⁸ F-fluorodeoxyglucose ^([18 F ] -FDG PET). ¹³ C spectroscopische magnetische resonantie imaging ⁽¹³ CMRSI) een minimaal invasieve imaging methode die de controle van metabolisme in vivo en in real time mogelijk maakt. Zoals met elk ander procédé gebaseerd op ^13C kernmagnetische resonantie (NMR), is de uitdaging lage thermische polarisatie en een daaropvolgende lage signaal-ruisverhouding als gevolg van de relatief lage gyromagnetische verhouding van ¹³ C en een lage natuurlijke overvloed in biologische monsters. Door het overwinnen van deze beperkingen is dynamische nucleaire polarisatie (DNP) gevolgd monster dissolutie kort ingeschakeld gebruikte NMR en magnetische resonantie imaging (MRI) systemen meten, Studie, en het belangrijkste metabole routes in verschillende biologische systemen. Een bijzonder interessante en veelbelovende molecule gebruikt ¹³ CMRSI is [1- ¹³ C] pyruvaat, die in de afgelopen tien jaar, is op grote schaal meer recent toegepast voor in vitro, preklinische en klinische studies naar het cellulaire energiemetabolisme onderzoeken bij kanker en andere ziekten. In dit artikel schetsen we de techniek van ontbinding DNP gebruik van een 3,35 T preklinische DNP hyper- en demonstreren het gebruik ervan in in vitro studies. Een soortgelijk protocol voor hyperpolarisatie worden toegepast voor het grootste deel in vivo studies ook. Hiervoor gebruikten we lactaat dehydrogenase (LDH) gekatalyseerde en de metabolische omzetting van [1- ¹³ C] pyruvaat om [1- ¹³ C] lactaat in een prostaatcarcinoom cellijn, PC3, in vitro gebruik ¹³ CMRSI.

Introduction

Momenteel is de meest gebruikte werkwijze voor klinische stagering, restaging behandeling aanspreekbewaking en herhaling detectie van diverse kankers ^[18 F] -FDG PET. ¹ Echter, onlangs, een aantal nieuwe en alternatieve benaderingen naar voren zijn gekomen. Een van die methodes is ¹³ CMRSI. Deze techniek houdt de invoering van de ¹³ C-molecuul in een biologisch monster, gevolgd door minimaal invasieve MRI om het metabolisme te beoordelen in vitro of in vivo in real time. Toch is de grootste uitdaging van ¹³ CMRSI, vergeleken met andere methoden zoals ^[18 F] -FDG PET of computertomografie, is de lage signaal-ruisverhouding.

Het NMR-signaal is recht evenredig met de mate van polarisatie, een verhouding van de spin ½ kernen verschil populatie in twee energietoestanden de totale populatie (Figuur 1A). De polarisatie is een product van the gyromagnetische verhouding (γ) van de kernen en het aangelegde magnetische veldsterkte over de temperatuur. Een typische polarisatie van ¹ H kernen in de orde van 0,001% tot 0,005% in 3 T, dat een relatief slechte signaal-ruisverhouding geeft. De huidige state-of-the-art MRI is een succesvolle beeldvormingstechniek is alleen door de grote dichtheid van ¹ H in biologische monsters en de hoge gyromagnetische verhouding van ¹ H (y _1H = 42,576 MHz / T). Echter, het waarnemen andere kernen, zoals koolstof, is veeleisender. De enige stabiele, magnetisch actieve kool isotoop ¹³ C, vertegenwoordigt slechts 1,1% van alle koolstofatomen. Bovendien, de gyromagnetische verhouding van ¹³ C _(13C γ = 10,705 MHz / T) vier maal lager dan die van ^1H, wat leidt tot een lagere detectie-efficiëntie. Samengevat, de lage ¹³ dichtheid en lage C γ _13C veroorzaken thermische ¹³ C gemeten tot 0,0176% van de gevoeligheid van een ¹ bereikenH-NMR meting in vivo.

Dynamic Nuclear Polarisatie

Werkwijze voor de relatief lage sensitiviteit van ¹³ C gemeten overwinnen is DNP. Het werd oorspronkelijk beschreven metalen in 1953 van Albert W. Overhauser. In zijn artikel, verklaarde hij: "Het is aangetoond dat als de electron spin resonantie van de geleidingselektronen verzadigd, de kernen worden gepolariseerd in dezelfde mate ze zouden zijn als de gyromagnetische verhouding waren die van het electron spin." ² later dat jaar, Carver en Slichter experimenteel bevestigd Overhauser hypothese ^3. In 1958, Abragam en Proctor beschreef dit effect voor elektronen in vloeistoffen en noemde het de "vaste-effect." Bij temperaturen onder 4 K, electron spin polarisatie bereikt bijna 100% en meer dan drie ordes van grootte hoger dan de kern-spin polarisatie (Figuur 1B) ^4. Thij treedt op omdat de gyromagnetische verhouding van het elektron _(e γ = 28024,944 MHz / T) is drie ordes van grootte hoger dan de nucleaire gyromagnetische verhouding. De zwakke wisselwerking tussen elektronen en kernen, zoals het Overhauser effect, het vaste zin crosseffect en de thermische mengwerking kan de overdracht van polarisatie van elektronspins naar kernspins via microgolfbestraling met een frequentie nabij de overeenkomstige elektron paramagnetische resonantie (EPR) frequentie ^5,6. DNP theorie is verder ontwikkeld om meer elektronen en thermische mengen omvatten. Niettemin, tot op heden geen uniforme kwantitatieve theoretische beschrijving van DNP is gepubliceerd ^7,8.

Figuur 1: Het begrijpen van Dynamic Nuclear Polarisatie en hyperpolarisatie. A) Een schematische vergelijking van de spin bevolkingin het thermisch evenwicht polarisatietoestand en het hypergepolariseerde toestand. B) De polarisatie is afhankelijk van de temperatuur. De polarisatie van een elektron (e ^-) bereikt 100% onder 1,4 K. De DNP voor de overdracht van de polarisatie van de e naar de ¹³ C kernen, die de polarisatie tot 10 ⁵ voudig verhoogt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

DNP introduceren in studies van biologische systemen gebruik ¹³ C NMR had daaropvolgende snelle dissolutie monster te ontwikkelen. 50 jaar na Overhauser hypothese, Jan H. Ardenkjaer-Larsen et al. loste het technisch uitdagende kwestie van het brengen van het hypergepolariseerde bevroren monster in vloeibare toestand met een minimaal verlies hyperpolarisatie ^6. Ontbinding DNP opende een nieuw onderzoeksgebied genaamd ¹³ CMRSIk, het verstrekken van een nieuwe methode om te onderzoeken en te karakteriseren verschillende ziektebeelden ^9,10. Zo stabiel dragers van een ongepaard elektron, een trityl groep tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) benzo [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) -methyl natriumzout (OX063) of (2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-yl) oxyl (TEMPO) wordt meestal gebruikt. Deze zijn gemengd met de gewenste ^13-gelabeld molecuul en blootgesteld aan bestraling met microgolven met een frequentie nabij de overeenkomstige EPR frequentie. Met deze techniek kan de polarisatie van ¹³ C kernen worden verhoogd tot 37% ^11. Dit resulteert in een 10-voudige ⁵ verhoging polarisatie ten opzichte van de thermisch evenwicht polarisatie ^11,12. Echter, zodra de microgolfstraling wordt gestopt en / of de ¹³ C-molecuul naar de vloeibare toestand, de polarisatie vervalt onder longitudinale relaxatietijd _(T1) van de ¹³ C kern die is gepolariseerd. Dus deuitvinding van de snelle ontbinding technieken of elke latere techniek het verkorten van de tijd voordat de experimentele meting (dwz injectie) is cruciaal voor biologische toepassingen ^13.

Er zijn drie belangrijke eisen waaraan de kandidaat molecuul moet voldoen voor een succesvolle ¹³ CMRSI studies. Ten eerste, de ¹³ C kern plaats moet een voldoende lange t ₁ (> 10 s) hebben. De keuze van de ¹³ C-label is cruciaal. De beste kandidaat kernen zijn koolstoffen zonder direct contact met ¹ H-kernen via een obligatie. Het moet ook snel worden gemetaboliseerd binnen 2-3 T ₁ keer, wat resulteert in een stroomafwaarts metaboliet met een significant verschillende chemische verschuiving van de oorspronkelijke stof. Het monstermengsel moeten ook een amorf glas als in vaste toestand, zodat de ruimtelijke verdeling vermindert de afstand tussen het elektron en ¹³ C, waardoor de transfer polarisatie. Indien de kandidaat molecuul amorf glas niet van nature vormt, moet goed oplosbaar in een glassing middel, zoals glycerol of dimethylsulfoxide ¹⁴ worden. Deze eisen leiden tot een relatief klein aantal kandidaat moleculen. Maar zelfs na de succesvolle ontdekking van een geschikt molecuul, het ontwikkelen van een werkende protocol voor hyperpolarisatie kan technisch uitdagend ^9,14,15 zijn.

De laatste jaren hebben verschillende substraten succes gepolariseerd zijn, zoals [1- ¹³ C] pyruvaat ^{12,16 – 36,} [2- ¹³ C] pyruvaat ³⁷ [1- ¹³ C] ethyl pyruvaat ³⁸ [1- ¹³ C ] ³⁹ lactaat, [1- ¹³ C] fumaraat ^{40-43, 13} C-bicarbonaat ^36,44,45, [1- ¹³ C] natriumacetaat ^{43,46 – 49, 13} C-ureum ^6,36,50,51 , [5- ¹³ C] glutamine ^15,52,53, [1- ¹³ C] glutamaat ^53,54 [1- ¹³ C] 2-oxoglutaraat ⁵⁵ [1- ¹³ C] alanine en anderen ^14,56. Een bijzonder interessante en meest gebruikte substraat voor hyperpolarisatie is [1- ¹³ C] pyruvaat. Het wordt veel gebruikt in preklinische studies om de cellulaire energie-metabolisme in verschillende ziekten ^14,17,22 te onderzoeken. [1- ¹³ C] pyruvaat voldoet aan alle eisen voor een succesvolle hyperpolarisatie, met inbegrip van een relatief lange T ₁ en snel transport over de celmembraan alvorens vervolgens wordt gemetaboliseerd. Preklinische studies met [1- ¹³ C] pyruvaat worden momenteel vertaald in de kliniek ^57.

Stofwisseling van pyruvaat

Het is bekend dat er een rechtstreeks verband tussen mutaties in DNA en veranderingen in hun metabole routes kanker cellen. Reeds in de jaren 1920, Otto Warburg Discovuitgegaan dat er een verhoogd metabolisme van glucose en de productie van lactaat in tumoren in vergelijking met gezond weefsel ^58-60. Vervolgens verschillende afwisselingen in andere metabole routes, zoals de pentose-fosfaat route, de citroenzuurcyclus, oxidatieve fosforylering en de synthese van nucleotiden en lipiden, zijn beschreven.

Pyruvaat is het eindproduct van glycolyse. In de tumor ondergaat anaërobe glycolyse gekatalyseerd door LDH ⁶¹ en reageert met de gereduceerde vorm van het co-enzym nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), waardoor lactaat en de geoxideerde vorm van co-enzym (NAD ^+). Alternatief pyruvaat ondergaat transamineringsreaktie reactie met glutamaat alanine te vormen, gekatalyseerd door alanine transaminase (ALT). Beide reacties zijn gemakkelijk omkeerbaar. Pyruvaat ondergaat gekatalyseerd door decarboxylering pyruvaat dehydrogenase (PDH) kooldioxide en acetyl-CoA, representing een irreversibele reactie bij deze stap. Afwisselingen in deze reactiesnelheden kunnen worden gekoppeld aan tumormetabolisme ^{17,21,22,25,62.} De metabole route zijn in figuur 2.

Figuur 2: Schematische weergave van de belangrijkste metabole reactie van pyruvaat. Pyruvaat / lactaat omzetting wordt gekatalyseerd door LDH en pyruvaat / alanine omzetting wordt gekatalyseerd door ALT. Pyruvaat is irreversibel omgezet in acetyl-CoA en CO ₂ door PDH en CO ₂ in een pH-afhankelijke evenwicht met bicarbonaat ^80. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De detectie van gehyperpolariseerde [1- ¹³ C] pyruvaat en zijn metabolieten is eerder aangetoond in de rat hijart ^{37,63 – 65, 66} lever, spieren en nieren ^62,67. Een studie toonde significante verschillen in de lactaat-to-alanine verhouding tussen de normale en vastten rattenlever en ⁶⁶ vertoonden een zeer verhoogde en gehyperpolariseerde [1- ¹³ C] lactaat niveau leverkanker ^68,69. Er zijn aanwijzingen dat de tumor rang kunnen worden geïdentificeerd in een transgene adenocarcinoom van muizen prostaatkanker (TRAMP) middels gehyperpolariseerde [1- ¹³ C] pyruvaat ^22, met het gehyperpolariseerde lactaat niveaus die een hoge correlatie met de histologische graad van de tumoren uitgesneden. De alanine gekatalyseerd van pyruvaat door ALT is ook gesuggereerd als een bruikbare marker in ratten leverkanker ^23.

Meten van de pyruvaat-lactaat metabole flux is gebruikt voor de monitoring ischemie ^63,65,70 en als reactie op behandeling met cytotoxische chemotherapie ^17,40, gerichte geneesmiddelen <sup> 24,25,41, of radiotherapie ²⁶ in diermodellen. Het is ook gebruikt voor de detectie van de fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K) remmer LY294002 reactie in glioblastoma en borstkanker muismodellen ^25. Veranderingen in pyruvaatstofwisseling in hersentumoren ²⁶ en prostaatkanker ^24,71 zijn eveneens waargenomen na behandeling.

prostaatcarcinoom

Prostaatcarcinoom is de belangrijkste kanker bij oudere mannen en de tweede belangrijkste kanker gerelateerde dood bij mannen wereldwijd ^72. Tot op heden zijn geen betrouwbare, niet-invasieve methoden beschikbaar voor een vroege diagnose en typering van prostaatkanker ^73,74, met nadruk op de dringende behoefte aan nieuwe metabole beeldvormende technieken aan strenge opsporing en enscenering van de patiënten mogelijk te maken. Prostaatcarcinoom werd gebruikt als een model om de mogelijkheden van ontbinding DNP in combinatie met ¹³ CMRSI in de patiënt aan te tonens ^57. Dit werk werd voortgezet in een eerste klinische studie in dienst [1- ¹³ C] pyruvaat en ¹³ CMRSI voor de beeldvorming van prostaatkanker, en het heeft onlangs is afgerond (NCT01229618).

De motivatie achter dit werk was om te illustreren in meer detail en voor een breder publiek de toepassing van de ¹³ CMRSI methode in een preklinische omgeving met cellen. Het meten van de LDH-gekatalyseerde metabolisme van [1- ¹³ C] pyruvaat om [1- ¹³ C] lactaat in vitro in de PC3 prostaatcarcinoom cellijn, tonen we de mogelijke toepassing van ontbinding DNP in in vitro studies en het adres van de cruciale stappen en uitdagingen tijdens de experimenten.

Protocol

1. Steekproef Stock Solution Voorbereiding Voeg gadoterate meglumine (GadM, 0,5 mol / l) geconcentreerde [1- 13 C] pyrodruivenzuur tot een eindconcentratie van 1-mmol / l GadM geven. Voeg trityl groep tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra (hydroxyethyl) benzo [1,2-4,5] -bis- (1,3) -dithiole-4-yl) – methyl natriumzout (OX063) aan dit mengsel tot een eindconcentratie van 15 mmol / L te geven. Vortex tot volledige oplossing. LET OP: Deze voorraad oplossing voorbereiding is ontworpen voor gebruik met ee…

Representative Results

De resultaten van de "microwave sweep" zijn aangegeven in figuur 3. Het toont aan dat de optimale frequentie van de microgolf [1- 13 C] pyruvaat monster op 94,156 GHz voor de lokale 3,35-T hyperpolarisator. Alle volgende hyperpolarisatie experiment (n = 14) werden uitgevoerd met deze microgolf frequentie met een vermogen van 100 mW. De microgolfbestraling werd gedurende 60 tot 80 minuten, wat leidt tot een vaste toestand hyperpolarisatie hoger dan 90%. De resultaten zijn weergegeven…

Discussion

¹³ CMRSI met gehyperpolariseerde probes is een veelbelovende methode om metabolisme in real time in vitro en in vivo. Een belangrijk aspect bij toepassing van deze experimentele werkwijze is de juiste normalisatie, met name wat betreft in vitro experimenten. Ten eerste, de voorbereiding van het monster moet behoren en consistent worden gedaan met dezelfde concentratie gehyperpolariseerd materiaal bereiken elk experiment. Dit vereist een nauwkeurige weging van zowel het monster gehyp…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS