Гиперполяризованный¹³ C Метаболический магнитно-резонансная спектроскопия и обработка изображений

Summary

Dynamic nuclear polarization with subsequent sample dissolution has enabled real-time studies of metabolism in biological systems. Hyperpolarized [1-¹³C]pyruvate was used to study lactate dehydrogenase activity in a prostate carcinoma cell line in vitro.

Abstract

В последние десятилетия новые методы стадирования опухоли, рестадировании, мониторинг реакции на лечение, а также выявления рецидивов различных видов рака появились в сочетании с позитронно – эмиссионной томографии внедренный с ¹⁸ F-фтордезоксиглюкозы ^([18 F ] -FDG ПЭТ). ¹³ C магнитно – резонансная томография спектроскопические ⁽¹³ CMRSI) является минимально инвазивный метод визуализации , который позволяет контролировать метаболизм в естественных условиях и в режиме реального времени. Как и с любым другим методом , основанным на ¹³ С ядерного магнитного резонанса (ЯМР), она сталкивается с проблемой низкой тепловой поляризации и последующего низким отношением сигнал-шум из – за относительно низкой гиромагнитного отношения ¹³ С и его низкой изобилие природных ресурсов в биологические образцы. Путем преодоления этих ограничений, динамическая поляризация ядер (DNP) с последующим растворением образца в последнее время позволило широко используется ЯМР и магнитно-резонансная томография (МРТ) систем для измерения, Изучение и изображения ключевых метаболических путей в различных биологических системах. Особенно интересной и перспективной молекулы используется в ¹³ CMRSI является [1- ¹³ С] пируват, который, в последние десять лет, широко используется для в пробирке, доклинические, и, совсем недавно, клинические исследования для изучения метаболизма клеточной энергии при раке и других заболеваний. В этой статье мы опишем технику растворения DNP с использованием 3,35 T доклинические DNP hyperpolarizer и продемонстрировать его использование в исследованиях в пробирке. Аналогичный протокол для гиперполяризации могут быть применены по большей части в исследованиях в естественных условиях , а также. Для этого мы использовали лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и катализируют метаболические реакции [1- ¹³ С] пируват в [1- ¹³ C] лактат в клеточной линии карциномы простаты, PC3, в пробирке с использованием ¹³ CMRSI.

Introduction

В настоящее время наиболее широко используется клинический метод стадирования опухоли, рестадировании, мониторинг реакции на лечение, а также выявления рецидивов широкого спектра раковых заболеваний является ^[18 F] -FDG ПЭТ. ¹ Тем не менее, в последнее время , несколько новых и альтернативных подходов появились. Одним из таких методов является ¹³ CMRSI. Этот метод включает введение C-молекулы ¹³ в биологическом образце, а затем минимально инвазивной МРТ для оценки метаболизма в пробирке или в естественных условиях в режиме реального времени. Тем не менее, самой большой проблемой ¹³ CMRSI, по сравнению с другими методами , такими как ^[18 F] -FDG ПЭТ или компьютерной томографии, является низкое отношение сигнал-шум.

Сигнал ЯМР прямо пропорционален уровню поляризации, отношение разности населения спин ½ ядер в двух энергетических состояниях к общей численности населения (рис 1А). Поляризация является продуктом-гогиромагнитное отношение е (γ) ядер и приложенное напряженность магнитного поля над температурой. Типичная поляризация ядер ¹ Н порядка 0,001% до 0,005% при 3 Т, что дает относительно плохое отношение сигнал-шум. Сегодняшнее состояние дел в современной МРТ является успешным методом визуализации только из – за высокой численности ¹ Н в биологических образцах и высокой гиромагнитному соотношении ¹ Н (у _1H = 42,576 МГц / T). Тем не менее, наблюдая других ядер, таких как углерод, является более сложным. Единственным стабильным, магнитно – активный изотоп углерода ¹³ С, составляет лишь 1,1% от общего числа атомов углерода. Кроме того, гиромагнитное отношение ¹³ C (γ _13С = 10,705 МГц / T) в четыре раза меньше , чем у ¹ Н, что приводит к более низкой эффективности обнаружения. Таким образом, низкое содержание ¹³ С и низкой γ _13С вызывают тепловые измерения ¹³ C для достижения 0,0176% от чувствительности ¹Измерение Н-ЯМР в естественных условиях.

Динамическая поляризация ядер

Способ преодолеть сравнительно слабую чувствительность ¹³ измерений С DNP. Первоначально он был описан для металлов в 1953 году Альберт В. Оверхаузером. В своей статье он заявил: "Показано , что если электронный спиновый резонанс электронов проводимости насыщается, ядра будут поляризованы в той же степени они были бы , если их гиромагнитное отношение было то , что спина электрона." ² В дальнейшем в том же году, Карвер и Слихтера экспериментально подтвердили гипотезу Оверхаузера ^3. В 1958 г. Абрагам и Проктор описал этот эффект для электронов в жидкостях и назвал его "твердый эффект." При температурах ниже 4 К, электрон-спиновой поляризации достигает почти 100% и более чем на три порядка выше , чем ядерно-спиновой поляризации (рис 1B) ^4. Tего происходит потому , что гиромагнитное отношение электрона (Г _е = 28024,944 МГц / T) на три порядка выше , чем ядерных гиромагнитных соотношениях. Слабые взаимодействия между электронами и ядрами, таких как эффект Оверхаузера, твердый эффект, перекрестный эффект, и эффект термического смешивания, позволяют передавать поляризации от электронных спинов ядерных спинов с использованием микроволнового излучения с частотой, близкой к соответствующему электрона парамагнитного резонанса (ЭПР) частота ^5,6. Теория ДНП получила дальнейшее развитие, чтобы привлечь большее количество электронов и тепловое перемешивание. Тем не менее, на сегодняшний день нет единого количественное теоретическое описание ДНП не было опубликовано ^7,8.

Рисунок 1: Понимание динамической поляризации ядер и гиперполяризации. А) Схематическое сравнение спиновой заселенностив состоянии теплового равновесия поляризации и гиперполяризованным состояния. Б) поляризации зависит от температуры. Поляризация электронов (е ^-) достигает 100% ниже 1.4 K. ДНП обеспечивает передачу поляризации от e- до ядер ¹³ С, что увеличивает их поляризацию до 10 ⁵ – кратно. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Для того, чтобы ввести ДНП в исследованиях биологических систем с использованием ЯМР ¹³ С, должны были быть разработаны последующее растворение быстрого образца. 50 лет после того, как гипотеза Оверхаузера, Ян Х. Ardenkjaer-Larsen и др. решена технически сложный вопрос о привлечении к гиперпол замороженного образца в жидкое состояние с потерей минимальным гиперполяризации ^6. Растворение DNP открыл новое поле исследований под названием ¹³ КМРЯ, обеспечивая новый метод для исследования и описания различных состояний ^9,10 болезни. В качестве стабильных носителей непарный электрон, тритильная радикала трис (8-карбокси-2,2,6,6-тетра (гидроксиэтил) -benzo- [1,2-4,5] -бис (1,3) -dithiole-4-ил) -метил натриевая соль (OX063) или (2,2,6,6-тетраметилпиперидин-1-ил) оксил (TEMPO) обычно используется. Они смешиваются с желаемой молекулой ¹³ С-меченого и подвергается воздействию микроволнового излучения с частотой , близкой к соответствующей частоте ЭПР. Используя эту технику, поляризация ядер ¹³ С может быть увеличена до 37% ^11. Это приводит к кратному усилению поляризации 10 ⁵ по сравнению с тепловой равновесной поляризации ^11,12. Тем не менее, как только микроволновое облучение прекращают и / или ¹³ С-молекула переходит в жидкое состояние, поляризация затухает с продольной релаксации (Т ₁₎ ядра ¹³ С , который был поляризован. Таким образомИзобретение быстрых методов растворения или любой последующий метод сокращения времени до экспериментального измерения (т.е. инъекции) имеет решающее значение для биологических применений ^13.

Существуют три основных требования , что молекула кандидат должен выполнить для успешного проведения ¹³ исследований CMRSI. Во- первых, ¹³ С ядром интерес должен иметь достаточно длинную T ₁ (> 10 лет). Выбор ¹³ С-метки имеет решающее значение. Лучшие ядра – кандидаты являются атомы углерода, не имеющие прямого контакта с ¹ Н-ядер через связь. Она также должна быть быстро метаболизируется в течение 2 – 3 Т – ₁ раз, что приводит к потоку продукта метаболизма с существенно различным химическим сдвигом от исходного вещества. Образец смеси должна также образовывать аморфное стекло , если в твердом состоянии , так что пространственное распределение уменьшает расстояние между электроном и ¹³ С, что позволяет трансфер поляризации. Если молекула кандидат не образует аморфное стекло , естественно, она должна быть очень хорошо растворимы в Остекление агента, такого как глицерин или диметилсульфоксид ^14. Эти требования приводят к относительно небольшому числу молекул-кандидатов. Тем не менее, даже после успешного открытия подходящей молекулы, разработка рабочего протокола для гиперполяризации может быть технически сложным ^9,14,15.

В последние годы некоторые субстраты были успешно поляризованным, такие как [1- ¹³ С] пируват ^{12,16 – 36,} [2- ^13С] пируват ^37, [1- ¹³ С] этилпируват ^38, [1- ¹³ C ] лактат ^39, [1- ¹³ C] фумарат ^{40 – 43, 13} С-бикарбонат ^36,44,45, [1- ¹³ C] ацетата натрия ^{43,46 – 49, 13} C-мочевина ^6,36,50,51 , [5- ¹³ C] glutamiпе ^15,52,53, [1- ¹³ C] глутамата ^53,54, [1- ¹³ C] 2-оксоглутарат ^55, [1- ¹³ C] аланин и другие ^14,56. Особенно интересным и часто используемый субстрат для гиперполяризации является [1- ¹³ С] пируват. Он широко используется в доклинических исследованиях для изучения клеточной энергии-обмен веществ при различных заболеваниях ^14,17,22. [1- ¹³ С] пируват отвечает всем требованиям для успешного гиперполяризации, в том числе относительно длинный T ₁ и быстрого переноса через клеточную мембрану перед впоследствии метаболизируются. Доклинические исследования с [1- ¹³ С] пируват в настоящее время переводятся в клинику ^57.

Метаболизм пирувата

Хорошо известно, что существует прямая связь между мутациями в ДНК рак клеток и изменение их метаболических путей. Уже в 1920-е годы, Отто Варбург DiscovERed , что существует повышенный метаболизм глюкозы и лактата в опухолях по сравнению с здоровой тканью ^{58 – 60.} В дальнейшем различные чередований в других метаболических путей, таких как пентозофосфатного пути, цикла трикарбоновых кислот, окислительного фосфорилирования и синтеза нуклеотидов и липидов, которые были описаны.

Пируват является конечным продуктом гликолиза. В опухоли, она подвергается анаэробный гликолиз , катализируемой ЛДГ ⁶¹ и вступает в реакцию с восстановленной формой кофермента никотинамидадениндинуклеотида (НАДН), в результате чего в лактат и окисленной формы кофермента (НАД ^+). В качестве альтернативы, пируват подвергается реакции переаминирования с глутамата с образованием аланина, катализируемой аланин-трансаминазы (АЛТ). Обе реакции легко обратимы. Пируват также подвергается декарбоксилирование, катализируемой пируват-дегидрогеназы (PDH) до диоксида углерода и ацетил-КоА, гepresenting необратимой реакции на этой стадии. Чередование этих скоростей реакций могут быть связаны с опухолью метаболизма ^{17,21,22,25,62.} Метаболических путей приведены на рисунке 2.

Рисунок 2: Схема реакции основного метаболического пирувата. Пируват / лактат превращение катализируется СДГ, и преобразование пирувата / аланин катализируется ALT. Пируват необратимо превращается в ацетил-КоА и СО ₂ PDH и СО ₂ находится в зависимости от рН равновесии с бикарбонатом ^80. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обнаружение гиперполяризованного [1- ¹³ С] пируват и его метаболитов было показано ранее на крысах онискусство ^{37,63 – 65,} печень ^66, мышцы и почки ^62,67. Одно исследование показало существенные различия в соотношении лактат-к-аланин между нормальным и голодном печени крысы ⁶⁶ и продемонстрировали высокую надземные и гиперполяризованного [1- ¹³ C] лактат уровень заболеваемости раком печени ^68,69. Существует доказательство того, что степень злокачественности опухоли могут быть идентифицированы в трансгенной аденокарциномой простаты мыши (TRAMP) с использованием гиперполяризованного [1- ¹³ С] пируват ^22, с гиперполяризованным уровней лактата , показывающие высокую корреляцию с гистологической степени подакцизным опухолей. Аланин , катализируемой из пирувата АЛТ также была предложена в качестве маркера в полезный крысы гепатоцеллюлярной карциномы ^23.

Измерение пируват-лактат метаболический поток был использован для мониторинга ишемии ^63,65,70 и в качестве реакции на лечение с химиотерапией ^17,40 цитотоксическое, таргетных препаратов <SUP> 24,25,41, или лучевая терапия ²⁶ на животных моделях. Он также используется для обнаружения фосфатидилинозитол 3-киназы (PI3K) ингибитором реакции LY294002 в мышиных моделях глиобластомы и рака молочной железы ^25. Изменения в пирувата в опухолей головного мозга ²⁶ и рак простаты ^24,71 также наблюдались после лечения.

карцинома простаты

Рак предстательной железы является преобладающей формой рака у пожилых мужчин и второй ведущей связанных с раком смерти у мужчин во всем мире ^72. На сегодняшний день нет надежных, неинвазивные методы не доступны для ранней диагностики и определения характеристик рака простаты ^73,74, подчеркивая настоятельную необходимость новых методов визуализации обмена веществ , с тем чтобы строгое обнаружение и постановку пациентов. Рак простаты был использован в качестве модели для демонстрации возможности растворения ДНП в сочетании с ¹³ CMRSI у пациентаS ^57. Эта работа была продолжена в первом клиническом испытании с использованием [1- ¹³ C] пирувата и ¹³ CMRSI для визуализации рака простаты, и она совсем недавно была завершена (NCT01229618).

Мотивацией данной работы , чтобы проиллюстрировать более подробно и для более широкой аудитории к применению метода ¹³ CMRSI в доклинической обстановке с клетками. Измерение ЛДГ-катализируемой метаболизм [1- ¹³ С] пируват в [1- ¹³ C] лактат в пробирке в клеточной линии карциномы простаты PC3, мы демонстрируем возможное применение растворения ДНП в исследованиях в пробирке и решения важных шагов и проблемы во время экспериментов.

Protocol

1. Образец исходного раствора Приготовление Добавить gadoterate меглумин (GadM, 0,5 моль / л) в концентрированной [1- 13 C] пировиноградной кислоты с получением конечной концентрации 1-ммоль / л GadM. Добавить тритильного радикала трис (8-карбокси-2,2,6,6-тетра (гидроксиэтил) -benzo- [1,2-4,5] бис- (1,3) -di…

Representative Results

Результаты "СВЧ развертки" показаны на рисунке 3. Это показывает , что оптимальная частота для СВЧ [1- 13 С] пируват образца на 94.156 ГГц для локального 3,35-T hyperpolarizer. Все следующие эксперименты гиперполяризации (п = 14) были выполнены с использованием этой микроволновой част…

Discussion

¹³ CMRSI с гиперполяризованных зондов является перспективным методом для контроля метаболизма в реальном времени в пробирке и в естественных условиях. Один очень важный аспект при использовании этого экспериментального процесса является надлежащей стандартизации, особ?…

Materials

HyperSense DNP Polariser	Oxford Instruments		3.35 T preclinical DNP hyperpolarizer
GE/Agilent MR901	GE Healthcare/Agilent Technologies		7 T preclinical MRI scanner, with small bore designed for experiments onrodent
Spinsolve Carbon	Magritek		1 T NMR spectrometer with permanent magnet
Deuterium Oxide	Sigma Aldrich	7789-20-0
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	7558-79-4
Sodium phosphate monbasic	Sigma Aldrich	7558-80-7
Sodium hydroxide	Sigma Aldrich	1310-73-2
Disodium edetate	Sigma Aldrich	6381-92-6
Pyruvic acid – 13C1	Cambridge Isotopes Laboratories	CLM-8077-1
Dotarem (0.5 mmol/L)	Guerbet		gadoterate meglumine
tris (8-carboxy-2,2,6,6-tetra-(hydroxyethyl)-benzo-[1,2–4,5]-bis-(1,3)-dithiole-4-yl)-methyl sodium salt (OX063)	GE Healthcare		trityl radical used as a sourse of free electron
PC3 cell line	ATCC	CRL1435
F-12K medium	ATCC	30-2004
Fetal Bovine Serum	ATCC	SCRR-30-2020
Trypsine-EDTA Solution, 1X	ATCC	30-2101
Sample plastic cup	Oxford Instruments
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013-MSDS