이 프로토콜의 전반적인 목적은 정확하게 정의 된 3D 인쇄 뇌 홀더 및 슬라이서 박스의 생성을 통해 조직학 섹션 자기 공명 영상 (MRI) 이미지 볼륨을 정렬하는 것이다.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
여기에 설명 된 프로토콜은 MRI 및 조직학 섹션 사이의 정확한 비교를 할 수 있습니다. 프로토콜은 이러한 마모 셋 또는 설치류 사람이나 작은 동물의 뇌에 적용 할 수있는 통합 된 형식으로 제공된다. 대형 (인간)에 대한 구체적이고 두뇌가 강조된다 (인간이 아닌 영장류와 설치류) 작은 및 첨부 된 비디오와 그림의 차이는 우리는 비단 원숭이에서 응용 프로그램을 보여줍니다. 접근 방법은 간단하지만,이 방법은 여러 단계뿐만 아니라 여러 종류의 소프트웨어의 사용을 요구한다. 또한, 잠재적으로이 방법의 정확도에 영향을주는 여러 가지 문제를 언급하는 것이 중요하다.
생체 MRI의 화질은 중요한 인자이다. MRI 디지털화 조직학 이미지 간의 이미지 해상도에서의 차이를 최소화하기 위해 가능한 한 작은 MRI 복셀의 크기가 사용되어야한다. 이 개념은 또한 사후 MRI의 화질에 적용된다. 증가하는 동안사후 MRI에서의 획득 시간이 제제는 기포 관련된 초점 신호 끊김 같은 이미지 아티팩트들을 도입 할 수있다, 더 높은 이미지 해상도를 허용한다. 이러한 아티팩트는 조직 영역을 모호뿐만 아니라 형상에 영향을 미칠 수있다. 또한, 사후 MRI에서 조직의 크기는 정착 과정 및 시간에 의해 영향을받을 가능성이 높다. 생체 내 생체 MRI 경기에 밀접 취득 중에 조각 형상 설정의 해부학 적 구조를 이용하여 근사화 될 수 있지만, 비선형 등록이 여전히 두 MRI 이미지 매칭 정밀도 높은 수준에 도달 할 필요가있을 것이다.
뇌 홀더와 슬라이서의 설계는 중요한 단계이다. 뇌의 디지털 모델을 만들 때, 평활 알고리즘은 다소 고정 뇌 모델 상대를 확대하는 것이 적용된다. 이 홀더 및 슬라이서로 뇌를 쉽게 삽입 할 수 있습니다 홀더에 날카로운 모서리를 줄여 &# 39;의 윤곽. 모델이 너무 클 경우 (예 : 5 % 이상), 뇌 MRI는 사후 및 / 또는 단면 동안 이동할 수있다. 또 다른 중요한 점은 소뇌 제대로 인쇄 3D 객체 내부에 배치되도록 뇌 모델의 설계를 적용하는 것이다. 소뇌가 부검 뇌에서 추출 중에 손상된 경우가 특히 어려울 수있다.
뇌 슬라이서 홀더를 인쇄 할 때, 3 차원 프린터 유형은 신중하게 선택되어야한다. 일부 다중 – 제트 프린터는 지지체 물질을 제거하기 위해 오븐을 이용하여 후 처리를 필요로한다. 이 프린터는 방수 및 데스크톱 융합 증착 모델링 (FDM) 프린터보다 상대적으로 내구성이 객체를 생성 할 수 있지만, 가열 공정은 뇌의 윤곽에 완벽하게 수직하지 않은 블레이드 격차를 작성, 약간 상자를 워프 할 수 있습니다 지원을 제거합니다.
뇌 절편 과정은 또 다른 중요한 단계입니다. 일을 절단하기 전에전자 석판으로 전체 뇌, 뇌가 뇌 슬라이서 내부에 단단하게 앉아 있는지 확인하는 것이 중요하다 : 약간의 압력이 뇌에 적용되는 어떤 움직임이 없어야합니다. 이로써 블레이드 연구자에 의해 설정된 위치에서 정확하게 뇌을 극복 할 수 있도록한다. 절단시 연속, 균형 잡힌 압력이 모두 블레이드 홀더 적용해야합니다. 블레이드의 선명도 및 조직의 강성에 따라 약간의 횡 절단 동작 평면 절단면을 유지하는데 바람직 할 수있다.
파라핀 매립 공정은 MRI 및 조직학 간의 오정렬의 원인이 될 수있다. 티슈 슬래브 매립 과정 카세트에 평평 앉아 있지 않으면, 마이크로톰의 절단면 및 슬래브의 표면 위치 사이의 기울기가있을 것이다. 이것은 모든 조직이 노출 된 평면을 찾을 수 없게 부분 절단이 필요하다. 틸트를 보정하는 한 가지 방법높은 등방성 해상도 사후의 MRI에서 보는면의 각도를 변경하는 것이다. 그러나, 이것은 일반적으로 이방성 해상도 (일반적으로 관상 슬라이스 두께)로 취득한 생체 MRI에서 수행하는 것은 거의 불가능하다.
마지막으로, 조직뿐만 아니라 (주름, 균열, 접이식) 슬라이드의 제조 동안 포르말린 고정 파라핀 기간 임베딩 (수축) 중 일부의 변형이 발생할 수있다. 이러한 변형 중 일부는 슬라이드 상에 전송하기 전에 수욕에서 4-5 ㎛의 섹션을 바꾸어 보정 될 수있다. 다른 변형 부분적 사후 MRI 이미지 조직학 디지털화 된 이미지의 변형 화상 coregistration를 수행함으로써 해결 될 수있다. 그럼에도 불구하고, 신중하고 숙련 된 연습과 변형을 최소화하는 섹션을 조직학하기 위해 MRI 볼륨을 일치에 가장 효과적인 방법이다.
결론적으로, 여기에 소개 된 방법은 INV 수 있습니다estigators 정확하게 MRI 소견의 기본 병리를 평가합니다. 보다 일반적으로, 그것은 식별 및 / 또는 염증이나 재유 수화와 같은 특정 병리학 적 프로세스를 대상으로 조사 연구를위한 새로운 MRI 바이오 마커를 검증하기위한 유망한 방법이다.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |