Используя технологию 3D печати для слияния с МРТ гистологии: Протокол для мозга Секционирование
Summary
Общей целью данного протокола является точное выравнивание магнитно-резонансная томография (МРТ) объемы изображений с помощью разделов гистологии создания заказных 3D печатных носителей мозга и коробки среза.
Abstract
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
Introduction
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол указано здесь дает точное сравнение между МРТ и гистологии секций. Протокол представлен в едином формате, который может быть применен к мозгу человека или мелких животных, таких, как мартышек или грызунов. Различия, характерные для больших (человека) и малые (нечеловеческий примат и грызунами) мозги подсвечиваются, а в сопроводительном видео и цифры, которые мы демонстрируем применение в мартышки. Несмотря на то, подход прост, метод требует много стадий, а также использование нескольких типов программного обеспечения. Кроме того, несколько вопросов, которые могут повлиять на точность этого метода важно упомянуть.
Качество изображения в естественных условиях МРТ является важным фактором. Чтобы свести к минимуму неравенство в разрешении изображения между МРТ и оцифрованных изображений гистологических, следует использовать наименьший возможный размер МРТ вокселей. Эта концепция также относится и к качеству изображения посмертном МРТ. В то время как увеличениевремя сбора в посмертных МРТ позволяет значительно более высокое разрешение изображения, препарат может ввести артефакты изображения, такие как узловые бросивших сигналов, связанных с воздушными пузырьками. Эти артефакты могут затенить участки ткани, а также влияет на его контур. Кроме того, размеры ткани на посмертных МРТ, вероятно, будут затронуты в процессе фиксации и длительности. В то время как в естественных условиях в естественных условиях экс матча МРТ может быть тесно сближены с использованием анатомических ориентиров в программе настройки геометрии среза во время приобретения, нелинейную регистрация будет по- прежнему необходимо достичь более высокой степени точности в соответствие эти два МРТ изображения.
Конструкция держателя мозга и ломтерезки также является важным шагом. При создании цифровой модели мозга, алгоритм сглаживания применяется, что слегка увеличивает модели относительно неподвижного мозга. Это позволяет легко вставлять мозга в держатель и ломтерезки и уменьшает острые углы держателя &# 39, S контур. Тем не менее, если модель является слишком большим (например, более чем на 5%), мозг может двигаться во время посмертных МРТ и / или секционирования. Другим важным моментом является то, чтобы адаптировать дизайн модели мозга так, что мозжечок правильно размещен внутри 3D печатного объекта. Это может быть особенно сложным, когда мозжечок был поврежден во время извлечения мозга при аутопсии.
При печати резателя мозга и держатель, тип 3D-принтер должен также быть тщательно подобраны. Некоторые мульти-струйных принтеров требуют последующей обработки с использованием печи для удаления материала подложки. В то время как эти принтеры могут производить объекты, которые являются водонепроницаемыми и относительно более прочным, чем для настольных слиты моделирования осаждения (FDM) принтеров, процесс нагрева, чтобы удалить опоры может слегка деформировать коробку, создавая пробелы лезвия, которые не являются строго перпендикулярно к контуру мозга.
Процесс мозга секционирования является еще одним важным шагом. Перед стрижкой тысе весь мозг в слябы, важно, чтобы убедиться, что мозг плотно сидит внутри резателя мозга: не должно быть никакого движения, когда небольшое давление наносят на мозг. Это сделает возможным для лезвий, чтобы прорваться через мозг в точном месте, установленном следователями. Непрерывный, сбалансированное давление должно применяться к обоим держателям лезвий при резке. В зависимости от остроты лезвий и жесткости ткани, небольшое поперечное движение резания может быть выгодным для поддержания плоских поверхностей реза.
Процесс парафино-вложение может также быть источником рассогласования между МРТ и гистологии. Если горбыль ткань не сидит прилегать к кассете во время процесса погружения, будет наклон между секущей плоскостью микротома и поверхностью вместо плиты. Это потребует резки непригодные секций, чтобы найти плоскую плоскость, в которой подвергается вся ткань. Один из способов коррекции наклонаэто путем изменения угла плоскости наблюдения на посмертных МРТ высокого разрешения изотропным. Тем не менее, это практически невозможно выполнить на естественных условиях МРТ в том, что обычно приобретается с разрешением анизотропного (обычно имеет толщину корональные слайсы).
И, наконец, ткань может испытывать некоторую деформацию в течение периода фиксации формалином и парафин (усадка), а также во время подготовки слайдов (складывающиеся, образование трещин, морщин). Некоторые из этих деформаций может быть исправлено путем помещения секции на водяной бане 4-5 мкм перед передачей на предметные стекла. Другие деформации могут быть частично решены путем выполнения деформируемый изображения Корегистрация из гистологических оцифрованных изображений посмертных МРТ изображений. Тем не менее, сводя к минимуму деформации с тщательной и квалифицированной практикой является наиболее эффективным подходом к соответствию объемов МРТ для гистологии секции.
В заключение отметим, что методология введена здесь позволяет инвestigators точно оценить основной патологии выводов МРТ. В более общем смысле, это является перспективным подходом для идентификации и / или проверки новых МРТ биомаркеров для научных исследований, нацеленных на конкретные патологические процессы, такие как воспаление или ремиелинизации.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
Materials
| 7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
| 38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
| Fomblin | Solvay Solexis | ||
| 50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
| Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
| Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
| Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
| Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
| Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
| Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
| ETOH | |||
| Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
| .75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
| Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
| Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
| Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
| Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
| Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
| Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software | |
References
- Evans, A. C., Frank, J. A., Antel, J., Miller, D. H. The role of MRI in clinical trials of multiple sclerosis: comparison of image processing techniques. Ann Neurol. 41 (1), 125-132 (1997).
- ‘t Hart, B. A., van Kooyk, Y., Geurts, J. J. G., Gran, B. The primate autoimmune encephalomyelitis model; a bridge between mouse and man. Ann Clin Transl Neurol. 2 (5), 581-593 (2015).
- Ontaneda, D., Hyland, M., Cohen, J. A. Multiple sclerosis: new insights in pathogenesis and novel therapeutics. Annu Rev Med. 63, 389-404 (2012).
- Guy, J. R., Sati, P., Leibovitch, E., Jacobson, S., Silva, A. C., Reich, D. S. Custom fit 3D-printed brain holders for comparison of histology with MRI in marmosets. J Neurosci Methods. 257, 55-63 (2016).
- Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Ann Biomed Eng. 33 (8), 1100-1112 (2005).
- Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in-vivo MRI for whole baboon brain. J Neurosci Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
- McGrath, D. M., Vlad, R. M., Foltz, W. D., Brock, K. K. Technical note: fiducial markers for correlation of whole-specimen histopathology with MR imaging at 7 tesla. Med Phys. 37, 2321-2328 (2010).
- Schormann, T., Zilles, K. Three-Dimensional linear and nonlinear transformations: An integration of light microscopical and MRI data. Hum Brain Mapp. 6, 339-347 (1998).
- Jiang, L., et al. Combined MR, fluorescence and histology imaging strategy in a human breast tumor xenograft model. NMR Biomed. 26 (3), 285-298 (2013).
- Absinta, M., et al. Postmortem magnetic resonance imaging to guide the pathologic cut: individualized, 3-dimensionally printed cutting boxes for fixed brains. J Neuropathol Exp Neurol. 73 (8), 780-788 (2014).
- Gaitán, M. I., et al. Perivenular brain lesions in a primate multiple sclerosis model at 7-tesla magnetic resonance imaging. Mult Scler. 20 (1), 64-71 (2014).
