Det övergripande målet med detta protokoll är att noggrant anpassa magnetisk resonanstomografi (MRT) bildvolymer med histologi sektioner via skapa anpassade 3D-tryckt hjärnhållare och slicer lådor.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Det protokoll som beskrivs här möjliggör en noggrann jämförelse mellan MRI och histologi avsnitt. Protokollet skall lämnas i ett enhetligt format som kan tillämpas på hjärnan hos människor eller små djur, såsom silkesapor eller gnagare. Skillnader som är specifika för stor (människa) och små (icke-mänskliga primater och gnagare) hjärnor markeras och i den medföljande videon och siffror vi visa att de i silkesapa. Även om tillvägagångssättet är okomplicerad, kräver metoden många steg samt användning av flera typer av programvara. Dessutom har flera frågor som kan påverka riktigheten i denna metod är viktigt att nämna.
Bildkvaliteten på den in vivo MRI är en viktig faktor. För att minimera skillnaden i bildupplösningen mellan MRI och digitaliserade histologiska bilder bör minsta möjliga MRI voxelstorlek användas. Detta koncept gäller även bildkvaliteten hos döden MRI. Medan den ökadeförvärvstiden i döden MRI tillåter mycket högre bildupplösning, preparatet kan införa bildartefakter såsom brännsignal avhopp i samband med luftbubblor. Dessa artefakter kan skymma områden av vävnad samt påverka dess kontur. Dessutom dimensioner vävnad på döden MRT är sannolikt att påverkas av fixeringsprocessen och varaktighet. Medan in vivo till ex vivo MR match kan vara nära approximeras genom att använda anatomiska landmärken i skiva geometri inställning under förvärv, skulle en icke-linjär registrering fortfarande vara nödvändigt för att uppnå en högre grad av noggrannhet i matchande dessa två MRI-bilder.
Utformningen av hjärnan hållaren och slicer är också ett avgörande steg. I skapandet av digital modell av hjärnan, är en utjämningsalgoritm appliceras som något förstorar modellen i förhållande till den fasta hjärnan. Detta möjliggör enkel införing av hjärnan i hållaren och skivare och minskar skarpa kanter i hållaren &# 39; s kontur. Men om modellen är för stor (t ex, med mer än 5%), hjärnan kan röra sig under postmortem MRI och / eller snittning. En annan viktig punkt är att anpassa utformningen av hjärnan modellen så att lillhjärnan är korrekt placerad inuti 3D tryckta objektet. Detta kan vara särskilt utmanande när lillhjärnan har skadats under hjärnan extraktion vid obduktion.
Vid utskrift hjärnan skivare och hållare, måste typen av 3D-skrivare också väljas med omsorg. Vissa multi-jet skrivare kräver efterbearbetning med hjälp av en ugn för att avlägsna stödmaterial. Även dessa skrivare kan producera föremål som är vattentäta och relativt mer hållbara än skrivbordet smält nedfall modellering (FDM) skrivare, att uppvärmningsprocessen ta stöd kan något tänja rutan, skapa blad luckor som inte är helt vinkelrät mot hjärnan kontur.
Hjärnan sektionering processen är en annan avgörande steg. Före skärning the hela hjärnan i plattor, är det viktigt att se till att hjärnan sitter tätt inne i hjärnan slicer: det bör inte finnas någon rörelse när ett lätt tryck appliceras på hjärnan. Detta kommer att göra det möjligt för bladen att skära igenom hjärnan på den exakta platsen bestäms av utredarna. En kontinuerlig, balanserat tryck bör tillämpas på både bladhållarna vid sågning. Beroende på skärpan av bladen och styvheten hos vävnaden, kan en liten tvärgående skärrörelse vara fördelaktigt för att upprätthålla plana snittytor.
Den paraffin inbäddning process kan också vara en källa till felaktig inriktning mellan MRI och histologi. Om plattan vävnaden inte sitter plant mot kassetten under inbäddning processen, kommer det att finnas en lutning mellan skärplanet av mikrotomen och ytan plats på plattan. Detta kommer att kräva att skära oanvändbara sektioner för att hitta en plan yta där all vävnad exponeras. Ett sätt att korrigera för lutningenär genom att ändra vinkeln på visualiseringsplanet på ytan med hög isotropa upplösning postmortem MRI. Detta är dock nästan omöjligt att utföra på in vivo MRI som vanligtvis förvärvas med anisotropisk upplösning (typiskt tjocka coronal skivor).
Slutligen kan vävnaden uppleva några deformation under formalin bindningstid och paraffininbäddning (krympning), såväl som under framställningen av bilder (falsning, sprickor, rynkor). En del av dessa deformationer kan korrigeras genom att sektionerna i ett vattenbad 4-5 pm innan du överför på diabilder. Andra deformationer kan delvis lösas genom att utföra deformerbara bild coregistration av histologiska digitaliserade bilderna till obduktion MRI-bilder. Ändå minimera deformationer med noggrann och kunnig praktiken är den mest effektiva metoden för att matcha MRI volymer till histologiska sektioner.
Sammanfattningsvis, den metod som införs här möjliggör investigators att korrekt bedöma den underliggande patologi MRT-fynd. Mer allmänt är det en lovande metod för att identifiera och / eller validera nya MRI biomarkörer för forskningsstudier som är riktade till särskilda patologiska processer, såsom inflammation eller remyelinisering.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |