Det overordnede målet med denne protokollen er å nøyaktig justere magnetic resonance imaging (MRI) bildevolumer med histologi seksjoner via etablering av tilpassede 3D-trykt hjerne holdere og slicer bokser.
Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume three-dimensionally. While MRI is an extremely sensitive tool for detecting tissue abnormalities, association of signal changes with an underlying pathological process is usually not straightforward. In the central nervous system, for example, inflammation, demyelination, axonal damage, gliosis, and neuronal death may all induce similar findings on MRI. As such, interpretation of MRI scans depends on the context, and radiological-histopathological correlation is therefore of the utmost importance. Unfortunately, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, thus complicating the comparison between histology sections and MRI. This article presents novel methodology for accurately sectioning primate brain tissues and thus allowing precise matching between histology and MRI. The detailed protocol described in this article will assist investigators in applying this method, which relies on the creation of 3D printed brain slicers. Slightly modified, it can be easily implemented for brains of other species, including humans.
In vivo MRI provides a noninvasive and sensitive measure of tissue integrity at the macroscopic level. Changes in MRI signal intensity seen in vivo are outcome measures in many ongoing clinical trials.1 While the intensity changes seen via MRI can identify areas of abnormality in the context of the whole brain, they are often not sufficiently specific to differentiate pathological processes. This is especially true of dynamic processes involving multiple pathologies. For example, in multiple sclerosis (MS) or its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), inflammation, edema, myelin degradation, axonal destruction, gliosis, and neuronal death overlap. 2, 3 To obtain the necessary specificity regarding the underlying pathology, context must be taken into account, together with knowledge of the histology of the MRI-identified abnormal tissues.
However, even in well-controlled animal experiments, matching histology with in vivo MRI is fundamentally challenging for various reasons. First, the difference in dimensional scales between histology sections and MRI is of several orders of magnitude.4 Second, for proper comparison, the orientation of MRI slice plane must match the sectioning plane of the brain tissue when cut. Due to the shape of the brain, it is very difficult to make consistently straight and accurate cuts when the brain is sitting on a flat surface. Third, the large size of the brain relative to a potentially small area of interest (lesion, tumor, etc.) creates a “needle-in-a-haystack” scenario for the pathologist processing the tissue. Fourth, even when the target tissue is found, it is commonly processed in such a way as to render virtually impossible an association with the original MRI data. Finally, traditional pathological sectioning of brain tissue is often imprecise and inconsistent, further complicating the comparison between histology sections and MRI images.
Previous attempts to overcome these challenges relied on the use of deformational algorithms to coregister the data and/or placement of fiducial markers within or around the tissue as a reference.5, 6, 7, 8 The former approach requires complex computational models that are particularly susceptible to complications due to data formatting, imaging artifacts, and changes caused by tissue processing.4 On the other hand, the latter approach introduces the possibility of contaminating or otherwise harming the tissue itself.9
The approach described here improves the transition between modalities through the use of postmortem MRI to bridge the gap between in vivo MRI and histology. Postmortem MRI provides three-dimensional (3D) images of the brain at higher resolution than can be achieved in vivo and furthermore provides the data needed for producing a morphologically accurate model of the brain surface. This digital model can then be used to create a 3D-printed custom holder for the brain. With careful positioning, the brain holder allows for precise, MRI-oriented brain sectioning, reducing the need for complex mathematical algorithms, and enables a focus on specific regions for targeted sampling.
Our laboratory recently introduced new methods for creating custom brain holders and slicers using postmortem MRI and 3D-printing technology for human10 and marmoset brains.4 The two methods allow for a more accurate correlation between MRI and histology in a research setting, and ultimately allow a deeper understanding of the specific pathology underlying MRI abnormalities. Carefully designed experiments, in which the brain is sampled repeatedly over time in vivo, can provide context for interpretation of the pathology, which in turn can add specificity to interpretation of the MRI. Here, we present a modified protocol in a unified framework that can be applied to any brain tissue, whether it derive from nonhuman primates, rodents, or humans. We provide detailed instructions, and a corresponding video, for the marmoset sectioning. Although the overall protocol applies to any type of brain, due to differences in MRI acquisition and tissue size, as well as the challenges encountered when dealing with specific brain types, there are some differences in the approach depending on the type of brain being processed. In this presentation, sections with “human” will denote differences in protocol specific to the human brain.
Protokollen skissert her gjør en nøyaktig sammenligning mellom MR og histologi seksjoner. Protokollen er presentert i et enhetlig format som kan brukes til hjernen hos mennesker eller små dyr, slik som silkeaper eller gnagere. Forskjeller er spesifikke for stor (human) og små (nonhuman primat og gnager) hjerner er uthevet, og i den medfølgende video og tallene vi viser programmet i marmoset. Selv om metoden er enkel, krever fremgangsmåten i mange trinn, så vel som bruk av flere typer av programvare. Dessuten flere saker potensielt påvirker nøyaktigheten av denne metoden er viktig å nevne.
Bildekvaliteten på in vivo MR er en viktig faktor. For å minimere forskjell i bildeoppløsningen mellom MR og digitalisert histologiske bilder, bør den minst mulige MR voxel størrelse benyttes. Dette konseptet gjelder også bildekvaliteten på den postmortem MR. Mens den økteOppkjøpet tid i postmortem MRI tillater mye høyere bildeoppløsning, forberedelse kan innføre bilderester som knutepunkter signaldropouts knyttet til luftbobler. Disse gjenstander kan skjule deler av vev, så vel som påvirker dens kontur. Videre er dimensjonene av vev på postmortem MR sannsynligvis vil bli påvirket av fikseringsprosessen og varighet. Mens in vivo til ex vivo MRI kamp kan tilnærmes ved å benytte anatomiske landemerker i skive geometri ble satt opp under anskaffelse, ville en ikke-lineær registrering likevel være nødvendig for å oppnå en høyere grad av nøyaktighet i samsvarer med de to MRI-bilder.
Utformingen av hjernen holderen og høvelen er også et viktig skritt. For å lage den digitale modellen av hjernen, er en mykningsalgoritme anvendt som litt forstørrer modellen i forhold til den faste hjernen. Dette muliggjør lett innføring av hjernen i holderen og kutte- og reduserer skarpe kanter i holderen &# 39; s kontur. Imidlertid, hvis modellen er for stor (for eksempel ved mer enn 5%), i hjernen kan bevege seg under den postmortem MR og / eller snitting. Et annet viktig poeng er å tilpasse utformingen av hjernen modellen slik at lillehjernen er riktig plassert inne i 3D-trykt objekt. Dette kan være spesielt utfordrende når lillehjernen har blitt skadet under hjernen utvinning ved obduksjon.
Når du skriver ut hjernen slicer og holder, må den type 3D-printeren også velges med omhu. Noen multi-jet skrivere krever etterbehandlet med en ovn for å fjerne støttemateriale. Selv om disse skriverne kan produsere objekter som er vanntett og relativt mer holdbart enn stasjonære smeltet deponering modellering (FDM) skrivere, til oppvarmingsprosessen fjerne Støttene kan lett fordreie boksen, lage blad hull som ikke er helt vinkelrett på hjernen kontur.
Hjernen seksjonering prosessen er et annet viktig skritt. Før du skjærer the hele hjernen til plater, er det viktig å sørge for at hjernen sitter tett inne i hjernen høvelen: det bør ikke være noen bevegelse når svakt trykk blir påført på hjernen. Dette vil gjøre det mulig for bladene for å skjære gjennom hjernen på den nøyaktige plasseringen satt av etterforskere. En kontinuerlig, balansert press bør brukes på begge bladholdere når du skjærer. Avhengig av skarpheten av bladene og stivheten av vev, kan en liten tverrgående skjærebevegelse være fordelaktig for å opprettholde plane snittflater.
Parafin-embedding prosessen kan også være en kilde til forskyvning mellom MR og histologi. Hvis vevet skive ikke sitter flatt mot kassetten under innleiringen prosessen, vil det være en vippe mellom skjæringsplanet på mikrotomen og overflaten sted av platen. Dette vil kreve kutte ubrukelige deler for å finne en flat plan der alle vev utsettes. En måte å korrigere for tilter ved å endre vinkelen av visningsplanet på høy-isotrope-oppløsning post mortem MRI. Dette er imidlertid nesten umulig å utføre på in vivo MRI som vanligvis er anskaffet med anisotropisk oppløsning (typisk tykke koronale stykker).
Endelig kan vevet oppleve noen deformasjon i løpet av formalin fikseringsperioden og parafin innebygging (krymping), så vel som under fremstilling av objektglass (folding, sprekkdannelse, rynker). Noen av disse deformasjoner kan korrigeres ved å sette 4-5 mikrometer seksjoner i et vannbad før de overføres til lysbilder. Andre deformasjoner kan delvis løses ved å utføre deformerbar bilde coregistration av de histologiske digitaliserte bildene til post mortem MR-bilder. Likevel, minimere deformasjoner med forsiktig og dyktige praksis er den mest effektive tilnærmingen til matchende MR volumer til histologi seksjoner.
I konklusjonen, metodikken introdusert her gjør investigators å vurdere nøyaktig den underliggende patologi MR-funn. Mer generelt er det en lovende metode for å identifisere og / eller validere nye MR biomarkører for forskningsstudier som er rettet mot spesifikke patologiske prosesser, for eksempel betennelse eller remyelinisering.
The authors have nothing to disclose.
The Intramural Research Program of NINDS supported this study. We thank the NIH Functional Magnetic Resonance Imaging Facility. We thank Jennifer Lefeuvre and Cecil Chern-Chyi Yen for assistance with postmortem MRI acquisition. We thank John Ostuni and the Section on Instrumentation Core Facility for assistance with 3D printing. Figure 1 of this work used snapshots from MeshLab, a tool developed with the support of the 3D-CoForm project.
7T/30cm USR AVIII Bruker MRI | Bruker Biospin | ||
38 mm Bruker Biospin volume coil | Bruker Biospin | ||
Fomblin | Solvay Solexis | ||
50 ml Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 21008-951 | |
Fisherbrand Gauze Sponges | Fisher Scientrific | 13-761-52 | |
Parafilm M All-Purpose Laboratory Film | Bemis | ||
Leica RM2235 rotary microtome | Leica | ||
Leica Disposable Blades, low profile (819) | Leica | ||
Cresyl Violet Acetate, 0.1% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 26089-01 | |
Luxol Fast Blue, 0.1% in 95% Alcohol | Electron Microscopy Sciences | 26056-15 | |
ETOH | |||
Ultimaker 2 Extended | Ultimaker | ||
.75 kg Official Ultimaker Branded PLA Filament, 2.85 mm, Silver Metallic | Ultimaker | ||
Axio Observer.Z1 | Zeiss | ||
Zen 2 (Blue Edition) | Zeiss | ||
Netfabb Professional 5.0.1 | Netfabb | http://www.netfabb.com/professional.php | |
Meshmixer 10.9.332 | Autodesk | http://www.meshmixer.com/download.html | |
Mipav 7.2 | NIH CIT | http://mipav.cit.nih.edu | |
Cura | Ultimaker | https://ultimaker.com/en/products/cura-software |