Introduction
In - vivo - Modellen des zentralen Nervensystems (ZNS) Erkrankungen erfordern eine effektive Bereitstellung von exogenen Substanzen, wie Medikamente, Krankheitserreger oder Exosomen, in das Gehirn. Daher sollte eine ideale Übermittlungsmethode minimalem Trauma für das Tier veranlassen, um die Integrität des neuronalen Netzes zu erhalten, und eine hohe Stoffkonzentrationen im Gehirn 1 erzielen.
Mehrere chirurgische Methoden der lokalen Substanzabgabe beschrieben wurden, einschließlich intra-Mantel, intrazerebrale und intraventrikuläre Injektionen oder Implantate 2, 3, 4, 5. Diese Ansätze sind jedoch als traumatisches zum ZNS und ermöglichen die Verabreichung von nur geringen Mengen der Substanz von Interesse. Außerdem wurde vorgeschlagen , dass exogene Substanzen können schnell durch die Zerebrospinalflüssigkeit 6 entfernt werden , 7 beobachtet, wenn die oben genannten Techniken eingesetzt werden. Systemische Liefermethoden, wie orale, pulmonale, subkutane und intravenöse Wege, sind häufiger in Tiermodellen verwendet, obwohl sie bei der Bereitstellung der Substanzen in das ZNS geringe Wirksamkeit aufweisen, aufgrund von anderen Organen Aufnahme 8, 9. Daher erfordern diese Verabreichungswege erhöhten Dosen der Substanzen verabreicht, 10 das Risiko von Nebenwirkungen und Toxizität zu, 11.
Hier beschreiben wir eine Maus Infusionsmikrotechnik, die effektiv Substanzen direkt in das Gehirn über die Arteria carotis interna liefert. Zusätzlich zu der Abgabe an das ZNS Targeting, ist diese Technik nicht die normale physiologische Barrieren umgehen und ist daher von großer Bedeutung für biological Prozesse in den Passagen von Therapeutika oder Krankheitserreger in das Gehirn beteiligt.
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Protocol
Die Verfahren in dem folgenden Protokoll beteiligt wurden von der University of Miami Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) zugelassen. Darüber hinaus werden alle Verfahren in Einrichtungen werden von der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Labor Animal Care International (AAALAC) genehmigt durchgeführt.
1. Herstellung von Mäusen für Chirurgie
- Anesthetize Maus mit Isofluran mit Sauerstoff gemischt, ein Labor, Anästhesie-System. Verwenden Sie Isofluran bei zwischen 4-5% und Sauerstoffstrom bei 2 l / min auf die kommerzielle Maschine einstellen (siehe Werkstoff-Tabelle). Bringen Sie das Tier zu der Operation Oberfläche, unter einem Stereomikroskop und Sustain Anästhesie einen Nasenkegel mit (verwenden Isofluran Einstellung 1,5-2,5 und Sauerstoffstrom bei 2 l / min).
- Stellen Sie sicher, dass die Maus Atemfrequenz liegt bei etwa 1 bis 2 Atmung / sec ohne Keuchen. Darüber hinaus gewährleisten, dass das Tier nicht Whiskers Stimulation nicht aufweist Reaktion und Pedal reflex (toe Prise). Überwachen Sie die Atemfrequenz und Aufwand während der Operation, mindestens alle 5 Minuten. Folgen Sie spezifische Institutional Animal Care und Use Committee und Veterinär Richtlinien zur Bekämpfung von Nagetieren Anästhesie Überwachung.
- Einen Tropfen ophthalmische Schmiermittel auf jedes Auge einen sterilen Tupfer, um mit Trockenheit zu verhindern. Verabreichung von entzündungshemmenden und schmerzlindernden Beschwerden zu lindern empfohlen.
- Mit dem Tier auf dem Rücken liegend, halten Anästhesie einen Nasenkegel verwenden.
- Reinigen Sie den Nackenbereich des Tieres durch Abwischen der Fläche, die dreimal mit Ethanol 70% und Chlorhexidin. Rasur der OP-Bereich des Tieres unter Verwendung einer Rasierklinge (siehe unten).
2. Dissektion der Arteria carotis communis (CCA)
- Führen Sie die gesamte mikrochirurgisches Verfahren unter einem Stereomikroskop. Mit chirurgische Scheren und Pinzetten führen eine flache Mittelschnitt im Nacken, von oberhalb des Brustbeins auf unter ter Backe (ca. 3 bis 4 cm).
- Mit einer Pinzette vorsichtig getrennten Fett- und Bindegewebe, um die Luftröhre aus.
- Legen Sie ein Kissen (rundes Objekt, etwa 0,5 cm im Durchmesser) auf der Rückseite des Halses der Maus, um den Hals zu verlängern, das weiterhin den Bereich auszusetzen.
- Trennen Sie das Gewebe entweder eine Geweberetraktor oder Haken.
- Auf der linken Seite der Trachea des Tieres, tweeze sorgfältig das Bindegewebe neben den linken CCA zu belichten.
- Mit einer Pinzette vorsichtig entfernen alle Bindegewebe der CCA Gabelung, und den Beginn der externen und internen Arteria carotis zu belichten.
3. Vorbereitung des CCA für Substanz Infusion
- Legen Sie zwei Segmente von Nylonfaden (ca. 1 cm jeweils) unter A. carotis externa (ECA), mit einer Pinzette.
- Legen Sie ein dauerhafter Knoten am höchsten Punkt möglich von der ECA.
- Am tiefsten Punkt möglich des ECA, unmittelbar über dem CCA Bifurkation Orteinen abnehmbaren Knoten. Dieser Knoten sollte locker sein im Vergleich zu dem oberen Knoten.
- Schließen Sie die CCA einen Behälter Clip, am tiefsten Punkt.
- Schließen Sie die A. carotis interna (ICA) mit einem Schiff Clip.
- Mit microdissection Feder Schere führen Sie einen kleinen Schnitt in der ECA (ca. 2 mm), zwischen den beiden Knoten.
4. Substanz Infusion über ICA
- Zubauen ein Infusionssystem. Bringen Sie 6 Zoll Kapillarschlauch (ideal Abmessungen: 2,5 mm x 1,2 mm) auf eine Tuberkulin-Spritze 250 & mgr; l der Substanz vorsichtig und legen Sie die Kapillarspitze in den Einschnitt infundiert (unter anderem Medikamente, Krankheitserreger, extrazellulären Vesikeln) ausgeführt werden in Schritt 3.6.
- Weiter die Kapillare nach unten rutschen, bis sie einen Mittelpunkt zwischen der Gabelung erreicht und den Clip des CCA zu schließen.
- Binden Sie den unteren ECA Knoten. Stellen Sie sicher, dass der Knoten locker genug ist Kapillare Fluidität und dicht genug, um zu verhindern, dass leakinG.
- Entfernen Clip aus dem ICA.
- Durch leichten Druck auf den Spritzenkolben zu ermöglichen Substanz Infusion etwa 10 & mgr; l pro Sekunde.
5. Nach Infusion Verfahren
- Platz Clip auf der ICA zurück.
- Entfernen Sie vorsichtig die Kapillarschlauchs.
- Binden Sie den unteren ECA Knoten vollständig.
- Entfernen Sie Clips aus dem ICA und der CCA.
6. Incision Closing und postoperative Pflege
- Entfernen Aufroller oder Gewebehaken und Kissen.
- Saubere Nahtbereich mit einer sterilen Kochsalzlösung.
- Schließen Sie den Schnitt mit Nylonfaden / Nadel und Pinzette.
- Verabreichen entzündungshemmende und analgetische postoperative Beschwerden zu lindern.
- Tier in den Käfig auf Heizkissen gelegt für mindestens 1 Stunde und Monitor Erholung.
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Representative Results
Die Maus Infusions Mikrochirurgie hier beschriebene Technik ist sehr vielseitig und verwendet wurde , verschiedene Stoffe zu liefern , direkt in das Gehirn, einschließlich der Lieferung von Tumorzellen in einem repräsentativen Modells der Hirnmetastasenbildung 1, 12.
Diese Technik ist auch geeignet, um die pathologischen Aspekte verschiedener Krankheitserreger im ZNS zu beurteilen. In einem Mausmodell der HIV-Infektion wurde die Infusions Chirurgie verwendet viralen Partikel direkt in den CCA zu injizieren. Wir fanden, dass 7 Tage nach der Operation, die für ZNS-HIV durch Echtzeit-PCR-positiv war. Weiterhin war die ipsilaterale Hemisphäre Infektion 6-10 Falten höher als die kontralateralen Hemisphäre (Abbildung 2).
Ein anderer geeigneter Ansatz der Infusions Chirurgie hier beschrieben wird, ist zu liefern extrazellulären Vesikeln (ECV), vor allem Exosomen, in das ZNS. Abbildung 3 zeigt die Gegenwart von CD63, einem Marker für Exosomen, markiert mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) in der ipsilateralen Gehirn einer Maus 24 Stunden nach der Infusion.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Infusion über die Arterie carotis interna. Im Einsatz (a) und (b) zeigen die Lokalisierung der oberen und unteren Knoten verbunden sind; (c) stellt den kleinen Schnitt in der ECA, durch welche das Kapillarrohr eingeführt wird (graue Linie). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2: HIV - Nachweis durch Real-time PCR nach Viral Infusion über die Arteria carotis interna. Die Balken zeigen Mittelwerte HIV - DNA geerntet von Mäusen , 7 Tage die Infusion über die linke Arteria carotis interna posten. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Immunfluoreszenz von Maus Brain Section Depicting GFP-markierten CD63, ein exosome Marker, nach ECV Infusion über die Arteria carotis interna. Das repräsentative Bild zeigt eine Maus Gehirn microvessel mit CD63 exprimieren ECV (grün) verbunden. Maßstabsbalken: 50 & mgr; m.erhalten = "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Infusions Mikrochirurgie hier beschrieben wurde , erwies sich bei der Bereitstellung von exogenen Substanzen verschiedener biologischer Funktionen in das ZNS sehr erfolgreich zu sein, verhindert unerwünschte Verbreitung im ganzen Körper 1, 12. Störung der Blut-Hirn-Schranke ist ein pathologisches Merkmal mehrerer ZNS zusammenhängenden Krankheiten; daher die Beurteilung der Beziehung von exogenen Substanzen mit dem Blut-Hirn-Schranke ist von großer Bedeutung und Interesse.
Diese Operation vorgestellte Modell verursacht begrenzte Trauma für die Tiere und ist mit sehr niedrigen Sterblichkeit 1, 12 verbunden. Darüber hinaus ist das Verfahren nicht mit der ZNS - Funktion oder zerebralen Blutfluß 1, 12 stören. Der wichtigste Aspekt dieses Verfahrens ist es, die richtigen Schnitt in der ECA auszuführen, die nur das ermöglichen sollteEinsetzen des Kapillarrohres. Ein breiterer Schnitt verursacht undichte des Stoffes infundiert werden, eine andere ECA Operation auf der gegenüberliegenden Seite zu erfordern. Um diese Situation zu vermeiden, sollte die Kapillarschlauchs einen größeren Durchmesser als der Schnitt haben, und auch eine scharfe Kante haben sollten, um seinen Eingang durch die Arterie zu erleichtern. In Bezug auf den technischen Aspekt ist, ein voll ausgebildetes Personal in der Lage diese Operation innerhalb von 20 Minuten durchzuführen.
Die wesentliche Einschränkung dieser Technik ist die Möglichkeit der Infusion nur einmal durch die gleiche ICA. Für wiederholte Substanzzuführsegment in das ZNS, ein Gefäß Mikroport verwendet werden muss , und wurde vorher 1 .Das Technik hier hat das Potential , beschrieben in den beschriebenen Untersuchungen über neue positive und negative Wechselwirkungen innerhalb der BBB, sowie ihrer Unterstützung zu liefern Pathogenen , Drogen und physiologische Mittel in das Gehirn.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia instrument | Vetequip | 901806 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tool | 14558-09 | |
| Surgical forceps straight tip | Fine Science Tool | 00108-11 | |
| Surgical forceps angled tip | Fine Science Tool | 00109-11 | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-08 | |
| Nylon suture | Braintree Scientific | SUT-S 104 | |
| Capillary tubing (Micro-Renathane 0.010” x 0.005” per ft.) | Braintree Scientific | MRE01050 | |
| Closing suture | VWR | 95057-036 | |
| Isoflurane | Piramal | ||
| 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride | FisherScientific | 50-121-8005 |
References
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