الميتوكوندريا الخلايا البطانية حاسمة للحفاظ على سلامة الدم في الدماغ من العوائق. ونحن نقدم على بروتوكول لقياس وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا بطانة الأوعية الدموية الدماغية.
سلامة الدم في الدماغ من العوائق (BBB) أمر بالغ الأهمية لمنع إصابات الدماغ. الدماغية البطانية الوعائية (CVE) الخلايا هي واحدة من أنواع الخلايا التي تتكون من BBB. هذه الخلايا لها رواجا جدا ذات طاقة عالية، الأمر الذي يتطلب وظيفة الميتوكوندريا المثلى. في حالة المرض أو الإصابة، وظيفة الميتوكوندريا في هذه الخلايا يمكن تغييرها، مما أدى إلى المرض أو افتتاح BBB. في هذه المخطوطة، ونحن نقدم طريقة لقياس وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا CVE باستخدام كلها، خلايا سليمة وbioanalyzer. ويتم استخدام فحص ميتو من التوتر للطعن في الخلايا التي تم مضطرب، سواء بدنيا أو كيميائيا، وتقييم وظيفتها الطاقة البيولوجية. بالإضافة إلى ذلك، يوفر هذا الأسلوب أيضا وسيلة مفيدة لفحص العلاجات الجديدة التي لها تأثيرات مباشرة على وظيفة الميتوكوندريا. لقد الأمثل لكثافة الخلايا اللازمة لانتاج معدلات استهلاك الأوكسجين التي تسمح لحساب مجموعة متنوعة من الفقرة الميتوكوندريامتر، بما في ذلك إنتاج ATP، والتنفس القصوى، والطاقة الفائضة. وتبين لنا أيضا حساسية الفحص من قبل مما يدل على أن إدخال الرنا الميكروي، مير 34A، يؤدي إلى انخفاض واضح وكشف في النشاط الميتوكوندريا. في حين أن البيانات الواردة في هذه الورقة هو الأمثل للخط الخلوي bEnd.3، لدينا أيضا إلى تحسين أداء بروتوكول للخلايا CVE الأولية، مما يشير إلى فائدة في النماذج قبل السريرية والسريرية.
ومن المسلم به على نطاق واسع أن الدم في الدماغ من العوائق (BBB) التي شكلتها خلايا المخ البطانية الوعائية (CVE) لديها وظائف مميزة جدا وفريدة من نوعها قصوى بالنسبة لعلم الأحياء الأوعية الدموية. هذه الخلايا البطانية استخدام الميتوكوندريا لتوليد معظم إمدادات الخلوي من الأدينوساين ثلاثي (ATP) كمصدر للطاقة كيميائية. وبالإضافة إلى توفير ATP للخلايا CVE، الميتوكوندريا تنظم العمليات الخلوية المختلفة في خلايا بطانة الأوعية الدموية، مثل الخلوية يشير 1-4، موت الخلايا المبرمج 5، والسيطرة على دورة الخلية ونمو الخلايا 6. ديسريغولاتيون وظيفة الطاقة البيولوجية الميتوكوندريا في الخلايا CVE قد تؤثر على نشوء حيوي الميتوكوندريا، مما يؤدي إلى ضعف النشاط البطانة الوعائية، وتفاقم الأمراض القلبية الوعائية والاضطرابات العصبية، على سبيل المثال، السكتة الدماغية 7،8 ومرض الزهايمر (AD) 9. لقد أثبتنا أن الإهانات إلى خلايا CVE بعد التعرض لlipopolysaccharide (LPS) يضعف وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا CVE وتفاقم السكتة الدماغية الحصائل 7. ثالثي butylhydroquinone (TBHQ) يزيد معدل وفيات السكتة الدماغية عن طريق التداخل مع الفسفرة المؤكسدة في الخلايا CVE 10. ولذلك، فإن نموذج كمي وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا CVE الطيارين ليس فقط سلسلة من الدراسات ذات الصلة آلية للنظام العصبي المركزي (CNS) الأمراض، ولكن أيضا يوفر انفراجة في فحص المخدرات من العلاجات التي تستهدف وظيفة الميتوكوندريا في علم الأحياء الأوعية الدموية.
وقد استخدمت الميتوكوندريا المعزولة لقياس وظيفة الطاقة البيولوجية. لدينا 7 وغيرها 11 وأفادت تقديرات الطاقة الحيوية الخلوية في الخلايا CVE سليمة باستخدام bioanalyzer تدفق خارج الخلية. يوفر محلل الاستفادة من تقييم الطاقة البيولوجية الخلوية الذاتية. هذا الاختبار حساس ويتفق يقيس استقلاب الميتوكوندريا من خلايا CVE، ويمكن استخدامها لتقييم ضعف الطاقة البيولوجية من الأمراض المنقولة جنسياالمولى، والتحقيق في آليات مسارات الإشارات الميتوكوندريا، والمخدرات الشاشة أو العلاجات التي تؤثر على وظيفة الميتوكوندريا في الخلايا CVE. يتم تسجيل معدل الأكسجين استهلاك (OCR) من قبل bioanalyzer باستخدام نهج التنميط الدوائية من خلال الجمع بين استخدام أربعة اختلال الميتوكوندريا: أوليغوميسين، الكربونيل السيانيد-4 (trifluoromethoxy) فينيل هيدرازون (FCCP)، روتينون، وantimycin A. في هذا البروتوكول، نحن بالتفصيل النهج الأمثل الذي يسمح للقياس وحساب المعلمات الوظيفية الميتوكوندريا في الخلايا CVE، بما في ذلك التنفس القاعدية الميتوكوندريا، إنتاج ATP، تسرب بروتون، التنفس القصوى، وقدرة الجهاز التنفسي الغيار، في فحص واحد.
ويمثل هذا البروتوكول وسيلة لتقييم النمط الظاهري الطاقة البيولوجية في خلايا بطانة الأوعية الدموية الدماغية. وهو بمثابة فحص أساسي لتقييم الميتوكوندريا الخلايا البطانية، وأنه هو الأمثل للتجارب تهدف إلى تحقيق آليات المحفزات التي قد تؤثر على مسار الإشارات الميتوكوندريا في الخلايا CVE. كما أنه يوفر طريقة لاختبار العلاجات المحتملة لأمراض المرتبطة BBB-اضطراب.
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
bioanalyzers تدفق خارج الخلية لديها القدرة على قياس التعرف الضوئي على الحروف في الوقت الحقيقي. في هذا الاختبار، وتحديد كثافة الخلية المناسبة أمر بالغ الأهمية. إذا كانت كثافة الخلية أقل من 8 × 10 3 خلايا لكل بئر، والتعرف الضوئي على الحروف القاعدية منخفضة جدا بحيث لا يمكن تحليلها (الشكل 2) والشكل (3)؛ إذا كانت كثافة الخلية فوق 32 × 10 3 خلايا لكل بئر، فإن الخلايا لا تستجيب للأوليغوميسين أو FCCP محطات الصرف الصحياليلة (الشكل 2 والشكل 3). كثافة الخلية المثلى لهذا الخط خلية في نموذج تجريبي لدينا هو 16 × 10 3 خلايا لكل بئر، والذي يدل على النتائج قابلة للتكرار وحساسية للمحفزات 7 والعلاجات 10،14. إذا تم استخدام bioanalyzer 24-جيدا، معايرات جديدة من كثافة الخلايا ستكون هناك حاجة لفحص.
تم توثيقه أن CVEs ديك كمية كبيرة من الميتوكوندريا مقارنة مع الخلايا البطانية أخرى أو أنواع الأنسجة 15،16، مما يشير إلى الحاجة إلى زيادة إنتاج الطاقة وأقل من الخلايا لقياس الطاقة الحيوية الأيض. اختبرناها عدة أنواع من الخلايا البطانية الدماغ، مثل الابتدائية وخلدت الفئران الخلايا البطانية الدماغية 7 و خلدت الخلايا البطانية الدماغية البشرية (بيانات غير منشورة). هذه الخلايا المطلوبة كثافة خلية مماثلة للوصول إلى مقبول التعرف الضوئي على الحروف (OCR التنفس القاعدية داخل 40-160 بمول / دقيقة للوحات 96-جيدا و50-400 بمول / دقيقة لمدة 24 لوحات أيضا) عندما تم إجراء فحص الطاقة الحيوية. Kaczara وآخرون. وذكرت قياس استقلاب الطاقة البيولوجية في السرة المنوال الخلايا البطانية الإنسان (HUVEC)، والتي تستخدم أعلى كثافة الخلية 17.
لم مجموعتنا يتم تقييم الخلايا سفينة من الأنسجة أو الأعضاء الأخرى. من الناحية النظرية، وbioanalyzer يحتمل أن تستخدم في أي نوع من الخلايا، ولكنه يتطلب تحقيق الاستفادة المثلى من فحص لكثافة الخلايا، خلية ثقافة المتوسط، والظروف والثقافة (قد تتطلب بعض خلايا معينة لوحات مغلفة لتنمو بشكل جيد). كان المطلوب أن يتم الانتهاء من التجارب للتأكد من معدل OCR ضمن النطاق المقبول. إذا كان التعرف الضوئي على الحروف في الخلايا البطانية من الأجهزة الأخرى هي أقل من CVEs من العقول، وزيادة كثافة الخلايا يمكن أن تساعد على الحصول في غضون مجموعة OCR مقبول. بدلا من ذلك، إذا كانت الخلايا لا تستخدم الفسفرة التأكسدية كمصدر رئيسي للطاقة، وbioanalyzer لن يكون أوبتيمال فحص.
وbioanalyzer يسمح لتعطيل متتابعة من سلسلة نقل الإلكترون، استنادا إلى الترتيب الذي يتم تطبيق الكواشف. أولا، يتم تطبيق أوليغوميسين، مما يعوق الخامس مجمع الميتوكوندريا (ATP سينسيز). ثانيا، FCCP، وهو uncoupler الإلكترون، يتم تطبيق، الأمر الذي يؤدي إلى اختلال تدرج البروتونات. وأخيرا، روتينون وأنتيمايسين إيه، التي تمنع الميتوكوندريا المجمعات الأول والثالث على التوالي، وتطبق أن يؤدي إلى تثبيط الكلي للتدفق الإلكترونات. ترتيب التعرض للمخدرات ضروري لأن المخدرات عرقلة نقل الإلكترون ردة فعل معينة سلسلة، ويمكن قياس التغييرات متتابعة لتعكس وظيفة الميتوكوندريا.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
لتقييم استجابة الميتوكوندريا إلى المحفزات في الخلايا CVE، فمن المستحسن أن يتم تطبيق محفزات لخلايا بعد الالتزام الخلايا إلى أسفل لوحة زراعة الخلايا (انظر الجدول الزمنيهو مبين في الشكل 1؛ انها عادة ما يستغرق 6 ساعة على الأقل). للحصول على نتائج قابلة للتكرار من العلاج، من المهم للغاية للحفاظ على كثافة الخلية متسقة. إذا صممت المعالجة المسبقة قبل البذر الخلية، وكثافة الخلايا لكل مرحلة ما قبل المعالجة يجب أن تقاس بدقة، باستثناء الخلايا الميتة عن البذر. إذا تم تضمين ترنسفكأيشن في التصميم التجريبي، الرجوع إلى بروتوكول ترنسفكأيشن الشركة المصنعة. موضح في البيانات المقدمة في الشكل (4)، وكان transfected مير 34A إلى خلايا CVE استخدام عدة lipofectamine ترنسفكأيشن، الأمر الذي يتطلب مستنبت الخلية خالية من المضادات الحيوية واختبار ميتو من التوتر لتقييم التغيرات في وظيفة التمثيل الغذائي مع overexpression من مير 34A . ويمكن أيضا أن يكون الأمثل الجرعات البلازميد، كما نشرت سابقا (13). تغيير آخر التي يمكن إدخالها على بروتوكول يتغير تركيزات المواد الكيميائية. منحنى المعايرة من أوليغوميسين، FCCP، و / أو روتينون وأنتيمايسين إيه يمكن أن يكون COMPLEتيد.
وبالإضافة إلى ذلك، إذا كان هذا الفحص يستخدم لإنتاجية عالية ويحلل من مختلف انواع المخدرات، ويقترح لتشمل فحص مواز لقياس بقاء الخلية وتكاثر الخلايا، والتي وصفت في المنشورات السابقة لدينا 7،13. تتأثر القيم التعرف الضوئي على الحروف بشكل كبير من عدد الخلايا (الشكلان 2 و 3)، وفحوصات تكاثر الخلايا وقدرتها على البقاء تستفيد تطبيع البيانات. ومع ذلك، والانتهاء من هذه القياسات ليست في تقدير كل مختبر الفردية.
القيود المفروضة على تقنية
الحد الأكبر من هذا البروتوكول هو أننا تستخدم فقط في المختبر نموذج الثقافة خلية في الدراسة. حاليا، لا توجد خارج الحي النماذج المتاحة أو النماذج الحيوانية التي يمكن أن تعالج الخلايا البطانية وظيفة الميتوكوندريا. ومن المتوقع أن يتم تطويرها لتقييم وظيفة الطاقة البيولوجية في الجسم الحي نماذج جديدة و <eم> خارج الحي في الدراسات المستقبلية.
الحد الآخر هو امتداد لتقييم حاجز التالية التدابير الطاقة الحيوية. لا يمكن إجراء التجارب لأنه، أولا، وبعد الانتهاء من القياسات الطاقة البيولوجية، وقللت من بقاء الخلية بعد تعطل كامل لسلسلة نقل الإلكترون. ثانيا، هناك حاجة لوحات وإدراج ثقافة خلية محددة للكشف عن القيم الطاقة الحيوية ولا تناسب إدراجات لتقييم الحاجز. لذلك، ليس هناك العديد من المقايسات الفنية التي يمكن أن يتم الانتهاء بعد الفحص الطاقة الحيوية. ومع ذلك، فإنه من المتوقع أن الأجهزة الخاصة يمكن تطويرها لأداء المقايسات الفنية السابقة للفحص الطاقة الحيوية.
أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة
التقنيات السابقة لتقييم وظيفة الميتوكوندريا اقتضت عزل الميتوكوندريا من الخلايا 18. هذا نيتقنية ث باستخدام bioanalyzer تسمح لقياس النشاط الميتوكوندريا في خلايا سليمة، الذي يحفظ أكثر من البيئة الخلوية من تقييم الميتوكوندريا المعزولة.
التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
تم تصميم هذا البروتوكول وضعت للخط الخلوي bEnd.3، وإنما هو أيضا متوافقة مع الأولية الدماغية البطانية الوعائية (pCVE) خلايا 7 أو غيرها من البطانة، ولقد أثبتنا هذا في المنشور السابق لدينا باستخدام خلايا pCVE 7. عندما يتم استخدام أنواع أخرى من البطانة، قد تكون هناك حاجة لطلاء لوحة الثقافة واستخدام عوامل النمو. ومع ذلك، فمن المستحسن فحص المعايرة لأنواع الخلايا الأخرى كذلك. يوفر هذا البروتوكول طريقة عامة ليتم اعتمادها في تقييم الطاقة الحيوية من خلايا CVE، وأنه يمكن مواصلة تطبيقها على دراسات آلية أو الاستجابات العلاجية في هذه الطريقة.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.
bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25-30 passages |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% in final |
Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
0.25% trypsin 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM in final |
Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM in final |
Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM in final |
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM in final |
Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM in final |
Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM in final |
Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |