Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi
Summary
Endotel hücre mitokondri, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü korumak açısından kritik önem taşımaktadır. Bu serebral vasküler endotel hücrelerinde bioenergetic fonksiyonu ölçmek için bir protokolü getirmektedir.
Abstract
Kan-beyin bariyer (KBB) bütünlüğü beyin hasarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri BBB oluşturan hücre tiplerinden biri olan; Bu hücreler optimum mitokondriyal fonksiyonunu gerektiren çok yüksek-enerji talebinin var. hastalık veya kaza durumunda, bu hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu hastalık veya BBB açılması ile sonuçlanır, değişmiş olabilir. Bu yazıda, bütün, sağlam hücreleri ve bir Bioanalyzer kullanarak CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için bir yöntem tanıtmak. Bir mito-stres tahlil ya fiziksel ya da kimyasal, bozulmuş olan hücreler meydan ve onların biyoenerjitik fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda mitokondriyal fonksiyon üzerinde doğrudan etkiye sahip yeni tedavi ajanlarının ekrana kullanışlı bir yol sağlar. Mitokondriyal para çeşitli hesaplanmasına imkan oksijen tüketim oranları elde etmek için gerekli olan hücre yoğunluğuna optimizeATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite de dahil olmak üzere metre. Ayrıca mıkroRNA, miR-34a giriş, mitokondriyal aktivite belirgin bir ve saptanabilir bir azalmaya sebep olduğunu göstererek tahlilin hassasiyetini göstermektedir. Bu çalışmada gösterilen veriler bEnd.3 hücre hattı için optimize edilmiş olsa da, biz de daha ileri preklinik ve klinik modellerde programı düşündüren, birincil CVE hücreleri için protokol optimize ettik.
Introduction
Yaygın serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri tarafından oluşturulan kan-beyin bariyeri (KBB) vasküler biyoloji için her şeyden çok farklı ve benzersiz işlevlere sahiptir olduğu kabul edilmektedir. Bu endotel hücreleri, kimyasal enerji kaynağı olarak adenosin trifosfat hücre kaynağı (ATP) en oluşturmak için mitokondri kullanımı. CVE hücreleri için ATP sağlamanın yanı sıra, mitokondri 1-4 sinyal hücresel vasküler endotel hücreleri, çeşitli hücresel işlemleri, apoptoz 5 ve hücre döngüsü kontrol edilmesi ve hücre büyümesini 6. CVE hücrelerde mitokondriyal biyoenerjik fonksiyonunun bozulması düzenleyen bozulmuş vasküler endotel aktivitesine yol açan, mitokondriyal biogenezi etkiler ve serebrovasküler hastalıklar ve nörodejeneratif bozukluklar, örneğin, felç 7,8 ve Alzheimer hastalığı (AD) 9 şiddetlendirebilir. Bu CVE hücrelere hakaretler lipopolysac maruz kaldıktan sonra göstermiştirsakarit (LPS) CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu bozabilir ve inme 7 sonuçlarını kötüleştirebilir. Bütilhidrokuinon (TBHQ) CVE hücrelerinde 10 oksidatif fosforilasyon ile müdahale ederek inme mortaliteyi artırmaktadır. Bu nedenle, CVE hücreleri sadece pilot merkezi sinir sistemi için bir mekanizma ile ilgili bir dizi çalışma (CNS) hastalıkları biyoenerjik fonksiyonunun niceliksel model, aynı zamanda, vasküler biyoloji mitokondriyal fonksiyonu hedefleme terapötik ilaç taramasında bir buluş sağlar.
İzole mitokondri biyoenerjitik fonksiyonu ölçmek için kullanılmıştır. Biz 7 ve diğerleri 11 ekstraselüler akı Bioanalyzer kullanarak sağlam CVE hücrelerinde hücresel Biyoenerjetiğin değerlendirmelerini bildirdi. analizör endojen hücresel biyoenerjetik değerlendirme avantajı sağlar. Bu, hassas ve tutarlı deney CVE hücrelerin mitokondrial metabolizmanın büyüklüğüne ve Şti bioenergetic bozukluğu değerlendirmek için kullanılabilirMuli, CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu etkileyen mitokondriyal sinyal yollarının mekanizmalarını ve ekran ilaçlar ya da tedaviler araştırmak. Bu protokolde, rotenone ve antimycin A. oligomycin, karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazonun (FCCP): Oksijen Tüketim Hızı (OCR) dört mitokondriyal bozucuların kullanımını birleştirerek bir farmakolojik profil yaklaşımı kullanılarak Bioanalyzer tarafından kaydedilir biz detay tek bir deneyde, ölçme ve bazal mitokondriyal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi dahil olmak üzere CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonel parametrelerin hesaplanması için izin veren bir optimize edilmiş bir yaklaşım.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, serebral vasküler endotel hücrelerinde biyoenerjik fenotipinin değerlendirilmesi için bir yöntemi temsil eder. Bu endotel hücre mitokondriyal değerlendirme için temel bir tahlil olarak hizmet eder ve bu CVE hücrelerde mitokondriyal sinyal yolağı etkileyebilir uyaranlara mekanizmalarının incelenmesi amacıyla tasarlanan deneylerde için en uygunudur. Ayrıca, BBB bozulması ile ilişkili hastalıklar için potansiyel terapötik test etmek için bir yöntem sağlar.
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Hücre dışı akı bioanalyzers gerçek zamanlı olarak OCR ölçme yeteneğine sahiptir. Bu tahlilde, uygun hücre yoğunluğu tespit önemlidir. Hücre yoğunluğu oyuk başına 8 x 10 3 hücre altında ise, taban OCR (Şekil 2 ve Şekil 3) analiz edilecek olan çok düşük olduğu; Hücre yoğunluğu oyuk başına 32 x 10 3 hücre üzerinde ise, hücreler oligomycin ya FCCP işlemesi yanıt yokNTS (Şekil 2 ve Şekil 3). Bizim deneysel modelinde bu hücre hattı için en uygun hücre yoğunluğu 7 ve tedavileri 10,14 uyaranlara tekrarlanabilir sonuçlar ve hassasiyet gösteren kuyu başına 16 × 10 3 hücredir. 24 oyuklu Bioanalyzer kullanılırsa, hücre yoğunluğu, yeni titrasyonları tahlili için gerekli olacaktır.
CVEs diğer endotel hücreleri ya da doku tipleri 15,16 ile karşılaştırıldığında mitokondri büyük bir hacme sahip olduğunu daha fazla enerji üretimi ve biyoenerjetik metabolizmayı ölçmek için daha az hücre ihtiyacını öne belgelenmiştir. Biz primer beyin endotel hücreleri çeşitli test ve fare serebrovasküler endotel hücrelerini 7 ölümsüzleştirdi ve insan serebrovasküler endotel hücrelerini (yayınlanmamış veri) ölümsüzleştirilmiş var. 160 pmol / dak – Bu hücreler 40 içinde olarak kabul edilebilir bir OCR (bazal solunum OCR ulaşmak için benzer bir hücre yoğunlukları gerekli96 oyuklu plakalar, ve 50-24 oyuklu plakalar 400 pmol / dakika) biyoenerji deney yapıldı. Kaczara ve ark., Daha yüksek bir hücre yoğunluğuna 17 kullanılan insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC), içinde bioenergetic metabolizma ölçüm bildirmiştir.
Grubumuz, diğer doku veya organlardan damar hücrelerini değerlendirmek vermedi. Teorik olarak, Bioanalyzer potansiyel olarak herhangi bir hücre tipi kullanılabilir ancak, hücre yoğunluğu, hücre kültür ortamı ve kültür koşulları (bazı özel hücrelerin de büyüme plakaları kaplanmış gerektirebilir) için tahlil optimize etmeyi gerektirir. Deneyler OCR oranını kabul edilebilir aralık içinde olduğundan emin olmak için tamamlanmış olması gereklidir. diğer organlarda endotel hücrelerinde OCR hücre yoğunluğu artan, beyinlerinden CVEs daha düşük ise, kabul edilebilir bir OCR aralığında almak için yardımcı olabilir. Hücreler enerji ana kaynağı olarak oksidatif fosforilasyon kullanmıyorsanız Alternatif olarak, Bioanalyzer bir optima olmazl deneyi.
Bioanalyzer reaktifler uygulandığı sırasına göre, elektron taşıma zinciri sıralı bozulması için izin verir. İlk olarak, oligomycin mitokondriyal kompleks V (ATP sintaz) inhibe eden, uygulanır. İkinci olarak, FCCP, bir elektron uncoupler proton gradyanı bozulmasına yol açar, uygulanır. Son olarak, mitokondriyal Kompleksi I ve III inhibe rotenon ve antimisin, sırasıyla elektron akışının toplam inhibisyonuna yol uygulanır. ilaca maruz kalma sırası ilaçların spesifik elektron taşıma zincir reaksiyonu engellemek için gereklidir ve ardışık değişiklikler mitokondriyal fonksiyon yansıtacak şekilde ölçülebilir.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
CVE hücrelerinde uyaranlara mitokondriyal yanıtı değerlendirmek için, hücrelerin hücre kültürü plakası altına yapıştırılır sonra uyaranlar (zaman çizelgesi bkz hücrelere uygulanır tavsiye edilirŞekil 1 'de gösterilen; Genellikle) en az 6 saat sürer. tedaviler ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, tutarlı hücre yoğunluğunu tutmak için son derece önemlidir. ön işlemler hücre tohumlama önce tasarlanmış, her ön-tedavisi için hücre yoğunluğu dikkatle tohumlama için ölü hücreleri hariç, ölçülmelidir. transfeksiyon deney tasarımı dahil edilirse, üreticinin transfeksiyon protokolü bakın. Şekil 4'de sunulan veriler göstermiştir miR-34A miR-34a aşırı ekspresyonu ile metabolik fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek için antibiyotik içermeyen hücre kültür ortamı ve Mito-stres testi gerektiren bir lipofektamin transfeksiyon kiti kullanılarak CVE hücrelerine transfekte edilmiştir . Daha önce 13 yayınlanan plazmid dozları da, optimize edilebilir. protokole yapılabilir bir diğer değişiklik reaktifler konsantrasyonları değişiyor. oligomycin, FCCP ve / veya rotenone ve antimisin bir titrasyon eğrisi komple olabilirTed.
Yüksek performans için kullanılan bu deney, çeşitli ilaçların analiz Buna ek olarak, hücre canlılığı ve önceki yayınlarda 7,13 tanımlanmıştır hücre çoğalmasını ölçmek için bir paralel tahlil içerir önerilmektedir. OCR değerleri anlamlı hücre sayısı (Şekil 2 ve 3) etkilenen ve hücre çoğalması ve canlılığı deneyleri veri normalleşme fayda vardır. Ancak, bu testlerin tamamlanması her laboratuvar takdirine kalmıştır.
Tekniğin Sınırlamalar
Bu protokolün en önemli kısıtlılığı, biz sadece çalışmada in vitro hücre kültürü modeli kullanılmış olmasıdır. Şu anda, endotel hücre mitokondrial fonksiyon hitap edebilir hiçbir kullanılabilir ex vivo modeller ya da hayvan modelleri vardır. Yeni modeller in vivo biyoenerjetik fonksiyonunun değerlendirilmesi için geliştirilmiş olması bekleniyor ve <em> ex vivo gelecekteki çalışmalarda.
Başka bir sınırlama biyoenerjetiğin tedbirler aşağıdaki bariyer değerlendirmelerinin uzantısıdır. İlk olarak, biyoenerjitik ölçümler tamamlandıktan sonra, hücre canlılığı, elektron taşıma zincirinin tam parçalanmadan sonra azalır, çünkü deneyler gerçekleştirilemez; İkinci, özel hücre kültürü plakaları ve ekler biyoenerjetik değerlerini tespit etmek için gerekli olan ve bariyer değerlendirmeler için ekler uymaz. Bu nedenle, biyoenerji tahlil sonra tamamlanabilir pek çok işlevsel tahliller değildir. Bununla birlikte, özel cihazlar biyoenerji deneyi öncesinde fonksiyonel tahliller yapmak için geliştirilebilir beklenmektedir.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için önceki teknikler hücrelerden 18 den mitokondri izolasyonu gerektirmiştir. bu neBioanalyzer kullanılarak W tekniği izole mitokondri değerlendirilmesi daha selüler ortamın fazla muhafaza sağlam hücrelerde mitokondriyal aktivite ölçümü sağlar.
Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
Bu protokol, tasarlanmış ve bEnd.3 hücre hattı için geliştirilmiş, ancak aynı zamanda primer serebral vasküler endotelyal (pCVE) hücreleri 7 ya da endotel ile uyumlu olduğunu ve pCVE hücreleri 7 kullanarak önceki yayında bu göstermiştir edilir. endotel diğer türleri kullanıldığında, kültür plakasının kaplama ve büyüme faktörleri kullanımı gerekebilir. Bununla birlikte, titrasyon testi gibi diğer hücre tipleri için tavsiye edilir. Bu protokol, CVE hücre Biyoenerjetiğin değerlendirilmesinde kabul edilmesi genel bir yöntem sunmaktadır ve bu daha da mekanizma çalışmaları da bu şekilde tedavi yanıtları tatbik edilebilir.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.
Materials
| bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25-30 passages |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% in final |
| Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
| 0.25% trypsin 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM in final |
| Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM in final |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM in final |
| Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM in final |
| Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM in final |
| Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM in final |
| Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
| Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
| Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |
References
- Quintero, M., Colombo, S. L., Godfrey, A., Moncada, S. Mitochondria as signaling organelles in the vascular endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 5379-5384 (2006).
- Liu, Y., Li, H., Bubolz, A. H., Zhang, D. X., Gutterman, D. D. Endothelial cytoskeletal elements are critical for flow-mediated dilation in human coronary arterioles. Med Biol Eng Comput. 46, 469-478 (2008).
- Al-Mehdi, A. B., et al. Perinuclear mitochondrial clustering creates an oxidant-rich nuclear domain required for hypoxia-induced transcription. Sci Signal. 5, ra47 (2012).
- Mironov, S. L., Ivannikov, M. V., Johansson, M. [Ca2+]i signaling between mitochondria and endoplasmic reticulum in neurons is regulated by microtubules. From mitochondrial permeability transition pore to Ca2+-induced Ca2+ release. J Biol Chem. 280, 715-721 (2005).
- Sutendra, G., et al. The role of Nogo and the mitochondria-endoplasmic reticulum unit in pulmonary hypertension. Sci Transl Med. 3, 88ra55 (2011).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11960-11965 (2009).
- Doll, D. N., et al. Mitochondrial crisis in cerebrovascular endothelial cells opens the blood-brain barrier. Stroke. 46, 1681-1689 (2015).
- Ren, X., Simpkins, J. W. Deciphering the Blood-Brain Barrier Damage in Stroke: Mitochondrial Mechanism. J Neuroinfect Dis. S2, e002 (2015).
- Pun, P. B., Lu, J., Moochhala, S. Involvement of ROS in BBB dysfunction. Free Radic Res. 43, 348-364 (2009).
- Sun, J., Hu, H., Ren, X., Simpkins, J. W. Tert-butylhydroquinone compromises survival in murine experimental stroke. Neurotoxicol Teratol. 54, 15-21 (2016).
- Modis, K., et al. Cellular bioenergetics is regulated by PARP1 under resting conditions and during oxidative stress. Biochem Pharmacol. 83, 633-643 (2012).
- Brown, R. C., Morris, A. P., O’Neil, R. G. Tight junction protein expression and barrier properties of immortalized mouse brain microvessel endothelial cells. Brain Res. 1130, 17-30 (2007).
- Bukeirat, M., et al. MiR-34a regulates blood-brain barrier permeability and mitochondrial function by targeting cytochrome c. J Cereb Blood Flow Metab. 36, 387-392 (2016).
- Hu, H., et al. Mitochondrial Impairment in Cerebrovascular Endothelial Cells is Involved in the Correlation between Body Temperature and Stroke Severity. Aging Dis. 7, 14-27 (2016).
- Oldendorf, W. H., Cornford, M. E., Brown, W. J. The large apparent work capability of the blood-brain barrier: a study of the mitochondrial content of capillary endothelial cells in brain and other tissues of the rat. Ann Neurol. 1, 409-417 (1977).
- Oldendorf, W. H., Brown, W. J. Greater number of capillary endothelial cell mitochondria in brain than in muscle. Proc Soc Exp Biol Med. 149, 736-738 (1975).
- Kaczara, P., et al. Carbon monoxide released by CORM-401 uncouples mitochondrial respiration and inhibits glycolysis in endothelial cells: A role for mitoBKCa channels. Biochim Biophys Acta. 1847, 1297-1309 (2015).
- Bharadwaj, M. S., et al. Preparation and respirometric assessment of mitochondria isolated from skeletal muscle tissue obtained by percutaneous needle biopsy. J Vis Exp. (96), e52350 (2015).
