मस्तिष्क संवहनी endothelial कोशिकाओं में bioenergetic समारोह के मूल्यांकन

Summary

Endothelial सेल माइटोकॉन्ड्रिया रक्त मस्तिष्क बाधा अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं। हम मस्तिष्क संवहनी endothelial कोशिकाओं में bioenergetic समारोह को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का परिचय।

Abstract

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​की अखंडता मस्तिष्क की चोट को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। सेरेब्रल संवहनी endothelial (CVE) कोशिकाओं सेल प्रकार है कि BBB समावेश में से एक हैं; इन कोशिकाओं को एक बहुत ही उच्च ऊर्जा की मांग है, जो इष्टतम mitochondrial समारोह की आवश्यकता है। बीमारी या चोट के मामले में, इन कोशिकाओं में mitochondrial समारोह, बदला जा सकता है रोग या BBB के उद्घाटन में जिसके परिणामस्वरूप। इस पांडुलिपि में, हम पूरे बरकरार कोशिकाओं और एक bioanalyzer का उपयोग करके CVE कोशिकाओं में mitochondrial समारोह को मापने के लिए एक विधि का परिचय। एक Mito-तनाव परख कोशिकाओं है कि, परेशान कर दिया गया है या तो शारीरिक या रासायनिक चुनौती है, और उनकी bioenergetic समारोह का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। साथ ही, इस विधि को भी नई चिकित्सा विज्ञान mitochondrial समारोह पर प्रत्यक्ष प्रभाव है कि स्क्रीन के लिए एक उपयोगी तरीका प्रदान करता है। हम सेल घनत्व ऑक्सीजन की खपत की दर है कि mitochondrial पैरा की एक किस्म की गणना के लिए अनुमति देते हैं उपज के लिए आवश्यक अनुकूलित हैमीटर, एटीपी उत्पादन, अधिक से अधिक श्वसन, और अतिरिक्त क्षमता भी शामिल है। हम यह भी प्रदर्शित किया कि microRNA, मीर 34a की शुरूआत, mitochondrial गतिविधि में एक स्पष्ट और पहचाने जाने कमी की ओर जाता द्वारा परख की संवेदनशीलता दिखाने के लिए। इस पत्र में दिखाया गया डेटा bEnd.3 सेल लाइन के लिए अनुकूलित है, हम भी प्राथमिक CVE कोशिकाओं के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित किया है, आगे preclinical और नैदानिक ​​मॉडल में उपयोगिता का सुझाव दे।

Introduction

यह व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त है कि रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) ​​मस्तिष्क संवहनी endothelial (CVE) कोशिकाओं द्वारा गठित संवहनी जीव विज्ञान के लिए सर्वोपरि बहुत ही अलग और अनूठा कार्य किया है। ये endothelial कोशिकाओं माइटोकॉन्ड्रिया का उपयोग करें (एटीपी) adenosine triphosphate के सेलुलर आपूर्ति का सबसे उत्पन्न करने के लिए रासायनिक ऊर्जा के स्रोत के रूप में। CVE कोशिकाओं के लिए एटीपी प्रदान करने के अलावा, माइटोकॉन्ड्रिया ^1-4 संकेत ऐसे सेलुलर के रूप में संवहनी endothelial कोशिकाओं में विभिन्न सेलुलर प्रक्रियाओं, apoptosis ^5, और सेल चक्र का नियंत्रण है और सेल के विकास को ^6। CVE कोशिकाओं में mitochondrial bioenergetic समारोह का अनियंत्रण को विनियमित mitochondrial biogenesis प्रभावित कर सकता है, बिगड़ा संवहनी endothelium गतिविधि के लिए अग्रणी है, और cerebrovascular रोग और neurodegenerative विकारों, जैसे, स्ट्रोक ^7.8 और अल्जाइमर रोग (ई) ⁹ बढ़ा सकते हैं। हम जानते हैं कि CVE कोशिकाओं को अपमान निम्नलिखित lipopolysac के लिए जोखिम का प्रदर्शन किया हैcharide (LPS) CVE कोशिकाओं में mitochondrial समारोह ख़राब और खराब हो स्ट्रोक परिणामों ^7। Tert-Butylhydroquinone (TBHQ) CVE कोशिकाओं ¹⁰ में आक्सीकारक फास्फारिलीकरण के साथ हस्तक्षेप से स्ट्रोक मृत्यु दर बढ़ जाती है। इसलिए, CVE कोशिकाओं न केवल पायलटों केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के लिए तंत्र से संबंधित अध्ययन की एक श्रृंखला (सीएनएस) रोगों में bioenergetic समारोह के मात्रात्मक मॉडल, लेकिन यह भी संवहनी जीव विज्ञान में mitochondrial समारोह को लक्षित चिकित्सा विज्ञान की दवा स्क्रीनिंग में एक सफलता है।

पृथक माइटोकॉन्ड्रिया bioenergetic समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हम ⁷ और दूसरों ¹¹ एक बाह्य प्रवाह bioanalyzer का उपयोग करके बरकरार CVE कोशिकाओं में सेलुलर बायोइनरजेटिक्स के आकलन की सूचना है। विश्लेषक अंतर्जात सेलुलर bioenergetic आकलन का लाभ प्रदान करता है। यह संवेदनशील है और लगातार परख CVE कोशिकाओं के mitochondrial चयापचय उपायों और एसटीआई द्वारा bioenergetic हानि का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैमूली, mitochondrial संकेत दे रास्ते के तंत्र, और स्क्रीन दवाओं या उपचार है कि CVE कोशिकाओं में mitochondrial समारोह को प्रभावित जाँच। ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) bioanalyzer चार mitochondrial disruptors के उपयोग के संयोजन के द्वारा एक औषधीय प्रोफाइलिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके दर्ज की गई है: Oligomycin, कार्बोनिल साइनाइड -4 (trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), rotenone, और antimycin ए इस प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से एक अनुकूलित दृष्टिकोण है कि एक भी परख में, माप और CVE कोशिकाओं में mitochondrial कार्यात्मक मापदंडों, बेसल mitochondrial श्वसन, एटीपी उत्पादन, प्रोटॉन रिसाव, अधिक से अधिक श्वसन, और स्पेयर सांस की क्षमता सहित की गणना के लिए अनुमति देता है।

Protocol

नोट: प्रोटोकॉल की योजना चित्र 1 में दिखाया गया है प्रक्रियाओं की एक समय भी शामिल है। 1. संस्कृति और CVE प्रकोष्ठों के पारित पूरा मध्यम विकास में संस्कृति CVE कोशिकाओं (bEnd.3 कोशिकाओं) (उच्च ग्लूकोज Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन एक T75 सेमी 2 टिशू कल्चर फ्लास्क में साथ पूरक। एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें। निकालें और सेल संस्कृति के माध्यम से त्यागें। 0.25% trypsin 0.03% EDTA समाधान के साथ सेल परत कुल्ला, और फिर से 1 – फ्लास्क Trypsin EDTA के समाधान के 2 एमएल और 3 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कुप्पी रख – 5 मिनट। एक औंधा माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं का निरीक्षण करें जब तक सेल परत अलग है। पूरा मध्यम विकास के 10 एमएल जोड़ें और धीरे pipetting द्वारा कोशिकाओं aspirate। 700 XG पर तरल पदार्थ और कोशिकाओं को एक 15-एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब और स्पिन में छानना 5 मिनट सेलुलर मलबे को हटाने के लिए। </lमैं> अपकेंद्रित्र ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। पूर्ण विकास के माध्यम के 10 एमएल जोड़ें और सेल गोली फिर से निलंबित। 5 मिनट के लिए 700 XG पर कोशिकाओं स्पिन। अपकेंद्रित्र ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागें। पुनः निलंबित 2.0 × 10 5 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में पूरा मध्यम विकास में सेल गोली (एक hemocytometer का उपयोग गिनती द्वारा निर्धारित; Trypan नीले धुंधला द्वारा मृत कोशिकाओं को बाहर)। नोट: हौसले से thawed कोशिकाओं के प्रयोगों के लिए कम से कम 3 मार्ग के लिए उप-सुसंस्कृत हैं। सेल संस्कृति प्लेटों पर 2. बीज और इलाज प्रकोष्ठों एक 96 अच्छी तरह बाह्य प्रवाह सेल संस्कृति की थाली पर बीज कोशिकाओं: 80 μL / अच्छी तरह से। 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति की थाली एक 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में रखें। नोट: 16 × 10 3 में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं 60 तक पहुंच जाएगा – 24 घंटे के भीतर 80% confluency। कोशिकाओं को एक रसायन के संपर्क में किया जा रहा है, तो उपचार जोड़ने कोशिकाओं को एक बार प्लेट नीचे से जुड़े होते हैं (8 – 24 h बाद देखनाडिंग)। नोट: अभिकर्मक प्रयोगों के लिए, पूरा मध्यम विकास में एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ नहीं है। 3. mitochondrial समारोह का आकलन Bioanalyzer का प्रयोग परख की शुरुआत करने से पहले, थाली करने के लिए बाह्य प्रवाह calibrant समाधान के 150 μL जोड़ने और सीओ 2 के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर incubating हे / एन द्वारा calibrant के साथ एक बाह्य प्रवाह सेंसर कारतूस हाइड्रेट। प्लेट वॉशर स्टेशन का उपयोग कर, पीएच 7.0 बाह्य प्रवाह परख मध्यम में सेल संस्कृति के माध्यम से बदल जाते हैं। 60 मिनट – 30 के लिए सीओ 2 के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। 8 माइक्रोन के Oligomycin, 4.5 माइक्रोन के FCCP, 10 माइक्रोन rotenone, और DMEM में 10 माइक्रोन antimycin एक का काम कर समाधान तैयार करें। लोड 25 कारतूस इंजेक्शन बंदरगाहों में शेयर समाधान के μL: पोर्ट ए, oligomycin; पोर्ट बी, FCCP; पोर्ट सी, rotenone और बाह्य प्रवाह परख के माध्यम से antimycin ए। परख प्रोटोकॉल लागू तालिका 1 में वर्णित के रूप में। bioanalyzer में हाइड्रेटेड कारतूस लोड और "प्रारंभ" बटन पर क्लिक करके अंशांकन प्रदर्शन करते हैं। अंशांकन पूर्ण होने पर, कारतूस नीचे की थाली हटाने और "अनलोड कारतूस" शीघ्र क्लिक करके सेल प्लेट लोड। सभी मापन के अंत तक परख जारी रखें। डेटा फ़ाइल को खोलने और bioanalyzer से दर मूल्यों प्राप्त करते हैं। एक स्प्रेडशीट फ़ाइल में डेटा निर्यात। 4. डेटा विश्लेषण नोट: डेटा विश्लेषण के लिए गणना नीचे तैयार कर रहे हैं। मूल्यों bioanalyzer साधन से प्राप्त कर रहे हैं के रूप में ओसीआर चित्रा 2 में प्रस्तुत किया। बेसल मूल्य से (माप 3) – बेसल श्वसन की गणना करने के लिए, गैर mitochondrial श्वसन (12 माप 10) घटाना। नोट: बेसल श्वसन = बेसल – गैर mitochondrial श्वसन = दर ③ – दर ⑩ ~ ⑫। एटीपी producti गणना करने के लिएबेसल मूल्य से (माप 3) – पर, एटीपी से जुड़े श्वसन (6 माप 4) घटाना। नोट: एटीपी उत्पादन = बेसल – एटीपी से जुड़े श्वसन = दर ③ – दर ④ ~ ⑥। अधिकतम श्वसन से (माप 7 – 9) – अधिकतम श्वसन की गणना करने के लिए, गैर mitochondrial श्वसन (12 माप 10) घटाना। नोट: अधिकतम श्वसन = अधिकतम श्वसन – गैर mitochondrial श्वसन = दर ⑦ ~ ⑨ – दर ⑩ ~ ⑫। अतिरिक्त क्षमता की गणना करने के लिए, अधिकतम श्वसन से बेसल मूल्य (माप 3) (- 9 माप 7) घटाना। नोट: अतिरिक्त क्षमता = अधिकतम श्वसन – बेसल = दर ⑦ ~ ⑨ – दर ③। एटीपी से जुड़े श्वसन (माप 4) से – प्रोटॉन रिसाव की गणना करने के लिए, गैर mitochondrial श्वसन (12 माप 10) घटाना। नोट: प्रोटॉन रिसाव = एटीपी से जुड़े श्वसन – गैर माइटोकॉन्ड्रियाएल श्वसन = दर ④ – दर ⑩ ~ ⑫।

Representative Results

ऑक्सीडेटिव तनाव के जवाब में CVE कोशिकाओं के bioenergetic समारोह का आकलन करने के लिए, हम murine मस्तिष्क microvascular endothelia सेल लाइन bEnd.3, जो प्राथमिक मस्तिष्क microvascular endothelial कोशिकाओं 12 के रूप में ही तुलनात्मक बाधा विशेषताओं को प्रदर्शित करता है चुना है। यह देखते हुए कि कैनेटीक्स और प्रतिक्रिया के रिश्तेदार तीव्रता विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच विविध हैं, प्रयोगों की पहली श्रृंखला चयापचय की रूपरेखा के लिए परख में उपयोग करने के bEnd.3 कोशिकाओं का इष्टतम संख्या की पहचान के द्वारा दर्जे का ओसीआर का स्तर प्राप्त करने के लिए डिजाइन किए गए थे, में दिखाया गया है चित्रा 2. मूल्यांकन के बाद, डेटा की मात्रा निर्धारित कर रहे हैं और चित्रा 3। बेसल श्वसन, अधिक से अधिक श्वसन में प्रस्तुत किया है, और स्पेयर सांस की क्षमता सेल घनत्व के साथ एक आनुपातिक प्रतिक्रिया देखी गई। हालांकि, एटीपी उत्पादन में कमी आई है, जब अच्छी तरह से प्रति 64 × 10 3 कोशिकाओं का चयन किया गया है, सुझाव है कि अधिक मिला हुआ सेल संस्कृति हैइस प्रयोग के लिए उपयुक्त नहीं है। 3 32 × 10 अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं, mitochondrial disruptors के जवाब पर आधारित है – इष्टतम सेल घनत्व 8 के बीच होते हैं। बाद के प्रयोगों के लिए, अच्छी तरह से प्रति 16 × 10 3 कोशिकाओं का एक बोने घनत्व ओसीआर में परिवर्तन का पता लगाने के लिए इष्टतम अनुमति देने के लिए इस्तेमाल किया गया था। अच्छी तरह से प्रति 16 × 10 3 कोशिकाओं का उपयोग करना, हम ओसीआर में उम्मीद की प्रतिक्रियाओं मनाया और दिखा दिया कि microRNA मीर 34a CVE कोशिकाओं में mitochondrial समारोह (चित्रा 4) कम कर देता है। हम पहले से सूचित किया है कि मीर-34a इन कोशिकाओं को 13 में आक्सीकारक फास्फारिलीकरण कम हो। दोहराया प्रयोगों भी पता चला है कि अधिक से अधिक श्वसन और अतिरिक्त क्षमता काफी 24 घंटे बाद अभिकर्मक पर CVEs में मीर 34a की overexpression की कमी हुई थी, यहां तक कि बेसल श्वसन, एटीपी उत्पादन, और प्रोटॉन रिसाव हालांकि कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन किया था (चित्रा 4) । ये डेटाCVEs में mitochondrial समारोह में परिवर्तन का पता लगाने के लिए bioanalyzer की संवेदनशीलता को प्रदर्शित करता है। सेल, प्लेट के लिए प्रयोग के लिए चित्रा 1. सामरिक योजना। समय, और कारतूस तैयारी संकेत दिया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 2. प्रतिनिधि कच्चे विभिन्न सेल घनत्व के साथ CVE प्रकोष्ठों में bioenergetic समारोह का डेटा। ऑक्सीजन की खपत की दर अलग सेल घनत्व के साथ CVE कोशिकाओं में मापा गया। डेटा ± एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 5); ओसीआर: ऑक्सीजन की खपत दर; FCCP: कार्बोनिल साइनाइड-4- (trifluoromethoxy) phenylhydrazone; सड़ांध / विरोधी एक: rotenone और antimycin ए ①, ②, और ③ बेसल श्वसन संकेत मिलता है; ④, ⑤, और ⑥ संकेत मिलता है एटीपी जुड़े श्वसन; ⑦, ⑧, और ⑨ अधिकतम श्वसन संकेत मिलता है; ⑩, ⑪, और ⑫ संकेत मिलता गैर mitochondrial श्वसन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 3. विभिन्न सेल घनत्व के साथ CVE प्रकोष्ठों में bioenergetic समारोह के प्रतिनिधि परिणाम है। बेसल श्वसन, एटीपी उत्पादन, अधिक से अधिक श्वसन, और अतिरिक्त क्षमता बायोइनरजेटिक्स द्वारा उत्पन्न कच्चे डेटा से गणना कर रहे हैं चित्रा 2 फार्मूले का उपयोग करने में कार्यात्मक परख धारा 4 में संकेत । डेटा का प्रतिनिधित्व ± एसडी मतलब (एन = 5); ओसीआर: ऑक्सीजन की खपत दर। च = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4: मीर 34a की कमी हुई bioenergetic समारोह के प्रतिनिधि परिणाम (ए) mitochondrial समारोह के कच्चे डेटा 24 घंटे बाद अभिकर्मक पर मीर 34a की overexpression के बाद।। (बी) बेसल श्वसन, एटीपी उत्पादन, अधिक से अधिक श्वसन, और अतिरिक्त क्षमता बायोइनरजेटिक्स चित्रा -4 ए में कार्यात्मक परख द्वारा उत्पन्न कच्चे डेटा से गणना कर रहे हैं; मापदंडों के फार्मूले धारा 4 मीर 34a की overexpression में संकेत द्वारा गणना कर रहे हैं 24 घंटे बाद अभिकर्मक पर CVE कोशिकाओं में mitochondrial समारोह को कम करता है। डेटा ± एसडी मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं (एन = 5); ओसीआर: ऑक्सीजन की खपत दर। ****, पी <0.0001।फ़ाइलें / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। तालिका 1 साधन भागो प्रोटोकॉल।

Discussion

इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क संवहनी endothelial कोशिकाओं में bioenergetic phenotype के मूल्यांकन के लिए एक विधि का प्रतिनिधित्व करता है। यह endothelial सेल mitochondrial मूल्यांकन के लिए एक बुनियादी परख के रूप में कार्य करता है, और यह उत्तेजनाओं के तंत्र कि CVE कोशिकाओं में mitochondrial संकेतन मार्ग प्रभावित कर सकता है की जांच करने के लिए डिजाइन प्रयोगों के लिए इष्टतम है। यह भी बीबीबी-व्यवधान से जुड़े रोगों के लिए संभावित चिकित्सा परीक्षण के लिए एक तरीका प्रदान करता है।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम

बाह्य प्रवाह bioanalyzers वास्तविक समय में ओसीआर उपाय करने की क्षमता है। इस परख में, उचित सेल घनत्व की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। सेल घनत्व प्रति अच्छी तरह से 8 × 10 ³ कोशिकाओं से नीचे है, बेसल ओसीआर बहुत कम विश्लेषण किया जा करने के लिए (2 चित्रा और चित्रा 3) है; अगर सेल घनत्व के ऊपर अच्छी तरह से प्रति 32 × 10 ³ कोशिकाओं है, कोशिकाओं oligomycin या FCCP treatme का जवाब नहीं हैएनटीएस (चित्रा 2 और चित्रा 3)। हमारे प्रयोगात्मक मॉडल में इस सेल लाइन के लिए इष्टतम सेल घनत्व में अच्छी तरह से है, जो दोहराया परिणाम और संवेदनशीलता को दर्शाता है ⁷ और उपचार ^10,14 उत्तेजनाओं को प्रति 16 × 10 ³ कोशिकाओं है। 24 अच्छी तरह से bioanalyzer प्रयोग किया जाता है, तो सेल घनत्व के नए अनुमापन परख के लिए आवश्यक होगा।

कि CVEs अन्य endothelial कोशिकाओं या प्रकार के ऊतकों ^15,16 के साथ तुलना में माइटोकॉन्ड्रिया की एक बड़ी मात्रा है यह दस्तावेज है, अधिक से अधिक ऊर्जा उत्पादन और बायोइनरजेटिक्स चयापचय को मापने के लिए कम कोशिकाओं के लिए जरूरत का सुझाव दे। हम इस तरह के प्राथमिक के रूप में मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के कई प्रकार के परीक्षण किया और murine cerebrovascular endothelial कोशिकाओं ⁷ अमर और मानव cerebrovascular endothelial कोशिकाओं (अप्रकाशित डेटा) अमर कर दिया है। इन कोशिकाओं को समान सेल घनत्व के लिए आवश्यक 40 के भीतर स्वीकार्य ओसीआर (बेसल श्वसन ओसीआर तक पहुंचने के लिए – के लिए 160 pmol / मिनट96 अच्छी तरह प्लेटें और 50 – 400 से pmol / 24 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए न्यूनतम) जब बायोइनरजेटिक्स परख प्रदर्शन किया गया था। Kaczara एट अल। मानव नाल नस endothelial कोशिकाओं (HUVEC) है, जो एक उच्च सेल घनत्व ¹⁷ इस्तेमाल में bioenergetic चयापचय को मापने की सूचना दी।

हमारे समूह के अन्य ऊतकों या अंगों से पोत कोशिकाओं का मूल्यांकन नहीं किया। सैद्धांतिक रूप से, bioanalyzer संभावित किसी भी कोशिका प्रकार पर इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह सेल घनत्व, सेल संस्कृति के माध्यम से, और संस्कृति की स्थिति (कुछ विशिष्ट कोशिकाओं में लिपटे प्लेटों आवश्यकता हो सकती है अच्छी तरह से विकसित करने के लिए) के लिए परख के अनुकूलन की आवश्यकता है। यह आवश्यक है कि प्रयोगों सुनिश्चित करने के लिए ओसीआर दर स्वीकार्य सीमा के भीतर है पूरा कर रहे है। अन्य अंगों से endothelial कोशिकाओं में ओसीआर दिमाग से CVEs की तुलना में कम है, तो सेल घनत्व में वृद्धि के लिए एक स्वीकार्य ओसीआर सीमा के भीतर प्राप्त करने में मदद कर सकते हैं। वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को ऊर्जा के मुख्य स्रोत के रूप आक्सीकारक फास्फारिलीकरण उपयोग नहीं कर रहे हैं, तो bioanalyzer नहीं एक ऑप्टिमा होगाएल परख।

bioanalyzer जिस क्रम में अभिकर्मकों लागू कर रहे हैं पर आधारित है, इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला के अनुक्रमिक विघटन के लिए अनुमति देता है। सबसे पहले, oligomycin लागू किया जाता है, जो mitochondrial परिसर वी (एटीपी synthase) को रोकता है। दूसरा, FCCP, एक इलेक्ट्रॉन uncoupler, लागू किया जाता है, जो प्रोटॉन ढाल के विघटन की ओर जाता है। अंत में, rotenone और antimycin ए, जो mitochondrial परिसर मैं और तृतीय रोकना, क्रमशः, इलेक्ट्रॉन प्रवाह की कुल निषेध करने के लिए नेतृत्व करने के लिए लागू कर रहे हैं। दवा जोखिम के क्रम में आवश्यक है क्योंकि दवाओं विशिष्ट इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला प्रतिक्रिया खंड है, और क्रमिक परिवर्तन mitochondrial समारोह को प्रतिबिंबित करने के लिए मापा जा सकता है।

संशोधन और समस्या निवारण

mitochondrial प्रतिक्रिया CVE कोशिकाओं में उत्तेजनाओं का मूल्यांकन करने के लिए, यह सिफारिश की है के बाद कोशिकाओं सेल कल्चर प्लेट नीचे का पालन कर रहे है कि उत्तेजनाओं कोशिकाओं को लागू कर रहे हैं (समय देखनाचित्रा 1 में दिखाया गया है; यह आम तौर पर कम से कम 6 घंटे लगते हैं)। उपचार से दोहराया परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह सेल घनत्व अनुरूप रखने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है। pretreatments सेल बोने के लिए पहले तैयार कर रहे हैं, तो प्रत्येक पूर्व उपचार के लिए सेल घनत्व को ध्यान से मापा जाना चाहिए, बोने के लिए मृत कोशिकाओं को छोड़कर। अभिकर्मक प्रयोगात्मक डिजाइन में शामिल है, तो निर्माता के अभिकर्मक प्रोटोकॉल को देखें। चित्रा 4 में प्रस्तुत डाटा में प्रदर्शन किया, मीर 34a एक lipofectamine अभिकर्मक किट है, जो मीर 34a की overexpression के साथ चयापचय समारोह में परिवर्तन का आकलन करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं से मुक्त सेल संस्कृति के माध्यम से और एक Mito-तनाव परीक्षण की आवश्यकता का उपयोग कर CVE कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट गया था । प्लाज्मिड की खुराक भी अनुकूलित किया जा सकता है, जैसा कि पहले ¹³ प्रकाशित किया। एक और बदलाव है कि प्रोटोकॉल के लिए बनाया जा सकता है अभिकर्मकों की सांद्रता बदल रहा है। Oligomycin, FCCP, और / या rotenone और Antimycin ए के एक अनुमापन वक्र comple हो सकता हैटेड।

इसके अलावा, इस परख उच्च throughput के लिए प्रयोग किया जाता है विभिन्न दवाओं का विश्लेषण करती है, तो यह एक समानांतर परख सेल व्यवहार्यता और सेल प्रसार, जो हमारे पिछले प्रकाशनों ^7,13 में वर्णित किया गया मापने के लिए शामिल करने के लिए सुझाव दिया है। ओसीआर मूल्यों में काफी सेल नंबर (आंकड़े 2 और 3) से प्रभावित हैं, और सेल प्रसार और व्यवहार्यता assays के डेटा को सामान्य बनाने को फायदा होगा। हालांकि, इन assays के पूरा होने के लिए प्रत्येक व्यक्ति प्रयोगशाला के विवेक पर है।

तकनीक की सीमाएं

इस प्रोटोकॉल के प्रमुख सीमा है कि हम केवल अध्ययन में इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल का इस्तेमाल किया है। वर्तमान में, वहाँ कोई कमरा पूर्व vivo मॉडल या पशु मॉडल है कि endothelial सेल mitochondrial समारोह को संबोधित कर सकते हैं। नयी मॉडल विवो में bioenergetic समारोह के मूल्यांकन के लिए विकसित किए जाने की उम्मीद कर रहे हैं और <eM> पूर्व भविष्य के अध्ययनों में विवो।

एक और सीमा बायोइनरजेटिक्स उपायों का पालन बाधा आकलन का विस्तार है। प्रयोगों, क्योंकि पहले, bioenergetic माप के पूरा होने के बाद, सेल व्यवहार्यता इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला का पूरा विघटन के बाद कम हो जाता है नहीं किया जा सकता है; दूसरा, विशेष सेल संस्कृति प्लेटों और सम्मिलित बायोइनरजेटिक्स मूल्यों का पता लगाने के लिए आवश्यक हैं और बाधा आकलन के लिए सम्मिलित फिट नहीं है। इसलिए, वहाँ कई कार्यात्मक assays कि बायोइनरजेटिक्स परख के बाद पूरा किया जा सकता नहीं कर रहे हैं। हालांकि, यह उम्मीद है कि विशेष उपकरणों बायोइनरजेटिक्स परख करने से पहले कार्यात्मक assays प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया जा सकता है।

मौजूदा / वैकल्पिक तरीके के लिए सम्मान के साथ तकनीक का महत्व

Mitochondrial समारोह का मूल्यांकन करने के लिए पिछले तकनीकों कोशिकाओं ¹⁸ से माइटोकॉन्ड्रिया के अलगाव जरूरी हो। इस nebioanalyzer का उपयोग कर डब्ल्यू तकनीक बरकरार कोशिकाओं में mitochondrial गतिविधि है, जो अलग-थलग माइटोकॉन्ड्रिया के मूल्यांकन की तुलना में सेलुलर पर्यावरण के अधिक बरकरार रखता है की माप के लिए अनुमति देता है।

भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश इस तकनीक माहिर के बाद

इस प्रोटोकॉल बनाया गया है और bEnd.3 सेल लाइन के लिए विकसित की है, लेकिन यह भी प्राथमिक मस्तिष्क संवहनी endothelial (pCVE) कोशिकाओं ⁷ या अन्य endothelium के साथ संगत है, और हम हमारे पिछले प्रकाशन pCVE कोशिकाओं ⁷ का उपयोग कर में इस प्रदर्शन किया है। जब endothelium के अन्य प्रकार उपयोग किया जाता है, संस्कृति की थाली की कोटिंग और वृद्धि कारकों के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। हालांकि, अनुमापन परख के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए सिफारिश की है। इस प्रोटोकॉल एक सामान्य विधि CVE कोशिकाओं के बायोइनरजेटिक्स के मूल्यांकन में अपनाई जाने वाली प्रदान करता है, और इसे आगे तंत्र के अध्ययन या इस तरह से चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं को लागू किया जा सकता है।

Materials

bEnd.3 cell line	ATCC	CRL-2299	25-30 passages
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Fetal bovine serum	Atlanta Biologicals	S12450	10% in final
Penicillin/Steptomycin	Hyclone	SV30010	1×100 stocking
0.25% trypsin 0.03% EDTA solution	Corning	25-053-CI
Sodium pyruvate	Corning	25-000-CI	1.0 µM in final
Glucose	Sigma	CAS 50-99-7	25 mM in final
Oligomycin	Sigma	O4876	1.0 µM in final
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920	0.5 µM in final
Rotenone	Sigma	R8875	1.0 µM in final
Antimycin A	Sigma	CAS 1397-94-0	1.0 µM in final
Plate wash station	Seahorse Bioscience
Extracellular flux bioanayzer	Seahorse Bioscience	XFe96
Extracellular flux cell culture plate	Seahorse Bioscience	102416-100
Extracellular flux sensor cartridge	Seahorse Bioscience	102416-100
Extracellular flux calibrant solution	Seahorse Bioscience	100840-000
Extracellular flux assay medium	Seahorse Bioscience	102365-100	PH buffered prior to assay