mitocondri delle cellule endoteliali sono fondamentali per mantenere l'integrità del sangue-cervello barriera. Introduciamo un protocollo per misurare la funzione bioenergetico nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali.
L'integrità del sangue-cervello-barriera (BBB) è fondamentale per prevenire lesioni cerebrali. endoteliale vascolare cerebrale (CVE), le cellule sono uno dei tipi di cellule che compongono il BBB; queste cellule hanno una domanda molto alta energia, che richiede la funzione mitocondriale ottimale. In caso di malattia o lesione, la funzione mitocondriale in queste cellule può essere alterato, causando malattia o l'apertura della BBB. In questo manoscritto, si introduce un metodo per misurare la funzione mitocondriale in cellule CVE utilizzando interi, cellule intatte e un Bioanalyzer. Un test mito stress viene utilizzato per sfidare le cellule che sono state perturbate, fisicamente o chimicamente, e valutare la loro funzione bioenergetica. Inoltre, questo metodo fornisce anche un modo utile per lo screening di nuove terapie che hanno effetti diretti sulla funzione mitocondriale. Abbiamo ottimizzato la densità cellulare necessaria per produrre consumi di ossigeno che consentono il calcolo di una varietà di para mitocondrialemetri, tra cui la produzione di ATP, la respirazione massima, e la capacità di riserva. Mostriamo anche la sensibilità del test, dimostrando che l'introduzione del microRNA, miR-34a, porta ad una diminuzione marcata e rilevabile in attività mitocondriale. Mentre i dati riportati nel presente documento è ottimizzato per la linea cellulare bEnd.3, abbiamo anche ottimizzato il protocollo per le cellule primarie CVE, suggerendo ulteriormente l'utilità in modelli preclinici e clinici.
E 'ampiamente riconosciuto che il sangue-cervello-barriera (BBB) formate da cellule endoteliali vascolari cerebrali (CVE) ha funzioni ben distinte e uniche di primaria importanza per la biologia vascolare. Queste cellule endoteliali utilizzano mitocondri per generare maggior parte della fornitura cellulare di adenosina trifosfato (ATP) come fonte di energia chimica. Oltre a fornire ATP per le cellule CVE, mitocondri regolano vari processi cellulari in cellule endoteliali vascolari, quali cellulari segnalazione 1-4, apoptosi 5, e il controllo del ciclo cellulare e la crescita cellulare 6. Disregolazione funzione bioenergetica mitocondriale nelle cellule CVE possono influenzare la biogenesi mitocondriale, portando ad alterata attività di endotelio vascolare, ed esacerbare le malattie cerebrovascolari e malattie neurodegenerative, per esempio, ictus 7,8 e malattia di Alzheimer (aD) 9. Abbiamo dimostrato che gli insulti alle cellule CVE a seguito dell'esposizione ad lipopolysaccharide (LPS) compromettere la funzione mitocondriale nelle cellule CVE e peggiorare ictus esiti 7. Terz-butil-idrochinone (TBHQ) aumenta la mortalità ictus interferendo con fosforilazione ossidativa delle cellule CVE 10. Pertanto, il modello quantitativo della funzione bioenergetica nelle cellule CVE non solo piloti una serie di studi meccanismo legati al sistema nervoso centrale (SNC) malattie, ma fornisce anche un importante passo avanti in screening di farmaci di terapie di targeting funzione mitocondriale in biologia vascolare.
mitocondri isolati sono stati utilizzati per misurare la funzione bioenergetica. Abbiamo 7 e altri 11 hanno riportato le valutazioni di bioenergetica cellulari in cellule intatte CVE utilizzando un Bioanalyzer flusso extracellulare. L'analizzatore offre il vantaggio di valutazione bioenergetica cellulare endogena. Questo test sensibile e coerente misura il metabolismo mitocondriale di cellule CVE e può essere utilizzato per valutare impairment bioenergetica da stimuli, indagare i meccanismi di vie di segnalazione mitocondriali, e farmaci schermo o trattamenti che influenzano la funzione mitocondriale nelle cellule CVE. Il consumo di ossigeno Rate (OCR) viene registrato dal bioanalizzatore utilizzando un approccio di profilatura farmacologico, combinando l'uso di quattro perturbatori mitocondriali: oligomicina, carbonile cianuro-4 (trifluoromethoxy) fenilidrazone (FCCP), rotenone, e antimicina A. In questo protocollo, abbiamo dettaglio un approccio ottimizzato che consente la misurazione e il calcolo dei parametri funzionali mitocondriali nelle cellule CVE, tra basale respirazione mitocondriale, la produzione di ATP, perdita protonica, la respirazione massima, e capacità respiratoria ricambio, in un singolo test.
Questo protocollo rappresenta un metodo di valutazione del fenotipo bioenergetico in cellule endoteliali vascolari cerebrali. Serve come un test di base per la valutazione dei mitocondri delle cellule endoteliali, ed è ottimale per esperimenti progettati per studiare i meccanismi di stimoli che possono influenzare il percorso di segnalazione mitocondriale nelle cellule CVE. Esso fornisce anche un metodo per testare potenziali terapie per le malattie BBB-rottura-associati.
I passaggi critici all'interno del protocollo
Extracellulari bioanalyzers di flusso hanno la capacità di misurare OCR in tempo reale. In questo saggio, identificando la densità cellulare appropriata è critica. Se la densità cellulare è inferiore a 8 × 10 3 cellule per pozzetto, basale OCR è troppo bassa per essere analizzati (Figura 2 e Figura 3); se la densità cellulare è al di sopra di 32 × 10 3 cellule per bene, le cellule non rispondono a oligomicina o FCCP lavornti (Figura 2 e Figura 3). La densità cellulare ottimale per questa linea di cellule nel nostro modello sperimentale è di 16 × 10 3 cellule per bene, che dimostra i risultati replicabili e la sensibilità agli stimoli 7 e trattamenti 10,14. Se si utilizza un bioanalizzatore 24 pozzetti, nuove titolazioni della densità delle cellule sarebbero necessari per il test.
E 'documentato che CVE hanno un grande volume di mitocondri rispetto ad altre cellule endoteliali o tipi di tessuto 15,16, suggerendo la necessità di una maggiore produzione di energia e un minor numero di cellule per misurare il metabolismo bioenergetica. Abbiamo testato diversi tipi di cellule endoteliali cerebrali, come primario e immortalate murine cellule endoteliali cerebrovascolari 7 e immortalate cellule endoteliali umane cerebrovascolari (dati non pubblicati). Queste cellule necessari simili densità di cellule per raggiungere il accettabili OCR (basale respirazione OCR entro 40-160 pmol / min per96 pozzetti e un 50 – 400 pmol / min per piastre da 24 pozzetti) quando è stata eseguita l'analisi bioenergetica. Kaczara et al. Riportata la misurazione del metabolismo bioenergetico nel umani vena ombelicale cellule endoteliali (HUVEC), che ha utilizzato una più alta densità cellulare 17.
Il nostro gruppo non ha valutato le cellule dei vasi provenienti da altri organi o tessuti. Teoricamente, il bioanalizzatore potrebbe potenzialmente essere utilizzato su qualsiasi tipo di cellula, ma richiede l'ottimizzazione del saggio per la densità cellulare, mezzo di coltura cellulare, e condizioni di coltura (alcune cellule specifiche possono richiedere piastre rivestite per crescere bene). È necessario che gli esperimenti sono completati per garantire il tasso di OCR è compreso nell'intervallo accettabile. Se l'OCR nelle cellule endoteliali da altri organi è inferiore CVE dal cervello, aumentando la densità cellulare può aiutare a ottenere all'interno di un intervallo OCR accettabile. In alternativa, se le cellule non si utilizza la fosforilazione ossidativa come loro principale fonte di energia, il bioanalizzatore non sarebbe un Optimal test.
Il bioanalizzatore consente l'interruzione sequenziale della catena di trasporto degli elettroni, in base all'ordine in cui vengono applicati i reagenti. Innanzitutto, oligomicina viene applicato, che inibisce mitocondriale Complesso V (ATP sintasi). In secondo luogo, FCCP, un disaccoppiatore elettroni, viene applicato, che porta alla distruzione del gradiente protonico. Infine, rotenone e antimicina A, che inibiscono mitocondriale complessi I e III, rispettivamente, vengono applicate portare ad una totale inibizione del flusso di elettroni. L'ordine di esposizione al farmaco è essenziale perché i farmaci bloccano la reazione a catena di trasporto degli elettroni specifico, e le modifiche sequenziali può essere misurato in modo da riflettere la funzione mitocondriale.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Per valutare la risposta agli stimoli mitocondriale nelle cellule CVE, si raccomanda che gli stimoli sono applicati ai celle dopo le cellule sono rispettati fondo piastra di coltura cellulare (vedi timelinedi figura 1; di solito ci vogliono almeno 6 ore). Per ottenere risultati riproducibili da trattamenti, è estremamente importante mantenere la densità cellulare coerente. Se pretrattamenti sono progettati prima della semina delle cellule, la densità delle cellule per ogni pre-trattamento deve essere attentamente valutato, escludendo le cellule morte per la semina. Se trasfezione è incluso nel disegno sperimentale, fare riferimento al protocollo di trasfezione del produttore. Dimostrato in dati presentati in Figura 4, miR-34a è stato trasfettato nelle cellule CVE utilizzando un kit Lipofectamine trasfezione, che richiede medio-antibiotici libere coltura cellulare e un test mito-stress per valutare i cambiamenti nella funzione metabolica con sovraespressione di miR-34a . Le dosi di plasmide possono essere ottimizzate, come precedentemente pubblicato 13. Un'altra modifica che può essere fatto al protocollo sta cambiando le concentrazioni dei reagenti. Una curva di titolazione di oligomicina, FCCP, e / o rotenone e Antimicina A può essere compleTed.
Inoltre, se questo test viene utilizzato per high throughput analisi di vari farmaci, si suggerisce di includere un saggio parallelo a misurare la vitalità cellulare e proliferazione cellulare, che è stato descritto nelle nostre precedenti pubblicazioni 7,13. I valori OCR sono significativamente interessate dal numero di cellulare (figure 2 e 3), ei saggi di proliferazione cellulare e la vitalità beneficio della normalizzazione dei dati. Tuttavia, il completamento di questi test sono a discrezione di ogni singolo laboratorio.
LIMITI DELLA TECNICA
Il principale limite di questo protocollo è che abbiamo usato solo una cellula in vitro modello di cultura nello studio. Attualmente, non ci sono vivo modelli disponibili EX o modelli animali che potrebbero risolvere la funzione mitocondriale delle cellule endoteliali. I nuovi modelli dovrebbero essere sviluppati per la valutazione della funzione bioenergetica in vivo e <em> ex vivo in studi futuri.
Un altro limite è l'estensione delle valutazioni barriera seguenti misure bioenergetici. Gli esperimenti non può essere eseguita in quanto, in primo luogo, dopo il completamento delle misurazioni bioenergetiche, la vitalità cellulare è diminuita dopo completa rottura della catena di trasporto degli elettroni; In secondo luogo, le piastre e gli inserti colture cellulari specifici sono tenuti a rilevare i valori bioenergetica e non si adattano inserti per le valutazioni di barriera. Pertanto, non ci sono molti saggi funzionali che possono essere completati dopo il test bioenergetica. Tuttavia, si prevede che i dispositivi speciali possono essere sviluppate per eseguire saggi funzionali prima del test bioenergetica.
Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
Tecniche precedenti per valutare la funzione mitocondriale reso necessario l'isolamento dei mitocondri dalle cellule 18. Questo netecnica w utilizzando bioanalizzatore consente la misurazione dell'attività mitocondriale in cellule intatte, che conserva più l'ambiente cellulare che valutare mitocondri isolati.
Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica
Questo protocollo è stato progettato e sviluppato per la linea cellulare bEnd.3, ma è anche compatibile con primaria endoteliali vascolari cerebrali (pCVE), le cellule 7 o altre endotelio, e lo abbiamo dimostrato nella nostra precedente pubblicazione utilizzando cellule pCVE 7. Quando vengono utilizzati altri tipi di endotelio, possono essere richiesti il rivestimento della piastra di coltura e l'impiego di fattori di crescita. Tuttavia, il saggio di titolazione è raccomandato per altri tipi di cellule pure. Questo protocollo offre un metodo generale da adottare nella valutazione delle bioenergetica di cellule CVE, e può essere ulteriormente applicata a studi meccanismo o risposte terapeutiche in questo modo.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.
bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25-30 passages |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% in final |
Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
0.25% trypsin 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM in final |
Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM in final |
Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM in final |
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM in final |
Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM in final |
Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM in final |
Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |