שימוש בערוצי Agarose לינארית ללמוד<em> תסיסנית</em> התנהגות זחל זחילה
Summary
הזחל תסיסנית היא מערכת מודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות. פרסום זה מתאר את השימוש של ערוצי agarose ליניארי לעורר התקפים מתמשכים של זחילה ושיטות ליניארי לכמת את הדינמיקה של מבנים הזחל במהלך התנהגות זחילה חוזרת.
Abstract
זחילה הזחל תסיסנית מתגלה כמודל רב עוצמה כדי לחקור את השליטה העצבית של התנהגות הסנסורית. עם זאת, התנהגות סריקה זחל על משטחים שטוחים פתוחים היא מורכבת, כולל: נעצר, מסתובב, ואת המתפתל. מורכבות זו ברפרטואר של התנועה מעכבת ניתוח מפורט של האירועים המתרחשים במהלך מחזור צעד לזחול יחיד. כדי להתגבר על מכשול זה, ערוצי agarose ליניארי נעשו מגבילי התנהגות זחל ישר, מתמשך, זחילה קצבית. באופן עקרוני, כי ערוצי agarose ואת גוף זחל תסיסנית הם ברורים אופטי, התנועה של מבנים הזחל שכותרתו ידי בדיקות ניאון-מקודדים גנטיים ניתן לנטר ללא פגע, זחלים-לנוע בחופשיות. בעבר, הזחלים הונחו ערוצים ליניאריים וזחילה ברמת האורגניזם השלם, לפלח שריר נותחו 1. בעתיד, זחלי זחילה בתעלות יכולים לשמש הדמית סידן לפקח נוירופעילות סופית. יתר על כן, שיטות אלה יכולים לשמש עם זחלים של כל גנוטיפ ועם כל ערוץ מעוצב חוקר. כך הפרוטוקול המובא להלן הוא ישים נרחבת ללימודים באמצעות זחל תסיסנית כמודל להבין שליטה מוטורית.
Introduction
המטרה הכללית של שיטה זו היא ללמוד זחילת זחל תסיסנית בפירוט. ניסויים על תנועה שחקו תפקיד חשוב בפיתוח ובדיקת תאוריות על שליטה מוטורית 2. באופן מסורתי תנועת נחקרת בעלי חיים ימיים (למשל, עלוקה, צמד, ראשן) 3. האופי החוזר והנשנה של תנועה אצל בעלי חיים אלה אפשר לחקר rhythmogenesis, לניתוח של אירועי biophysical נהיגת תנועה, ולצורך מעקב את דפוסי הירי העצביים שמלווים תנועה.
שימוש זחלים תסיסנית ללימודים של תנועה מציג שילוב ייחודי של יתרונות על פני מערכות מודל אחרות: גנטיקה קלילה, פיתוח היטב מאופיין, גוף ברור אופטי ב instars הראשון והשני, וכן שחזור מיקרוסקופי אלקטרוני שידור מתמשכים של כל מערכת העצבים 4-6. עם זאת, זחל תסיסנית לוקותנועה על משטחים שטוחים פתוחים מעט מורכבת כולל הפסקות, מסתובבת, המתפתל זוחל 7. פרסום זה מציג שיטה להשתמש בערוצי agarose ליניארי להנחות התנהגות של תנועת זחל תסיסנית כך זחלים מבצעים מתמשכים, ישר, התנהגות סריקה קצבית.
לימוד התנהגות זחל תסיסנית בערוצי agarose, במקום התנהגות על משטחים פתוחים שטוחים, יש מספר יתרונות. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לבחור זוחל התנהגות במיוחד מתנועות רבות שהן חלק מהרפרטואר ההתנהגותי הזחל. שנית, על ידי התאמת הרוחב של הערוץ אל מול גודל גוף הזחל, מהירות זחילה יכולה להיות מותאמת. שלישית, ערוצי לאפשר הזחל כדי שיוצג מן הגב, הגחון, או צד לרוחב תלוי איך הזחל טעון אוריינטציה בתוך הערוץ. רבגוניות זו באורינטצית זחל מאפשרת לכל מבנה העניין להיות גלוי ללא הרף במהלך סריקה. רביעי,ערוצים ניתנים לשימוש עם מגוון רחב של מיקרוסקופים ויעדים. לדוגמא, ניתן להשתמש בערוצים ליניארית הדמיה ברזולוציה נמוכה על stereoscopes שדה בהיר ו / או הדמיה ברזולוציה גבוהה על מיקרוסקופי confocal-דיסק מסתובב 1. החמישית, בשיטה זו ניתן להשתמש בשילוב עם optogenetic / מניפולציות עצביות thermogenetic בכל רקע גנטי. לבסוף, כי הן גוף הזחל (ב instars הראשון והשני) וערוצי agarose ברורים אופטי, ערוצים ניתן להשתמש כאשר לומדים את התנועות הדינמיות, או שינויים בעוצמת פלורסנט מבנים הזחל שכותרתו ידי בדיקות ניאון גנטית בקידוד.
השיטה המתוארת היא מתאימה ללימודי קינמטיקה מפורטים של instar הראשון ושני התנהגות תסיסנית זחל. פרסום זה מנתח את השינויים הדינמיים עוצמת פלורסנט של מערכת העצבים המרכזית במהלך זחילה הזחל קדימה כדי להדגים את השימוש של ערוצים כמבשר neuהדמית סידן רונאל.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשיר microfluidic נבנה כדי להפוך את ערוצי agarose ליניארי שיכול להכיל זחלים תסיסנית (איור 1). כאשר זחלים תסיסנית ממוקמים ערוצי agarose הליניאריות האלה הרפרטואר ההתנהגותי שלהם מוגבל זחילה, המאפשרת תצפית מפורטת של הדינמיקה של מבנים הזחל על פני מחזור הזחילה.
<p c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
- Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature. J Neurosci. 32 (36), 12460-12471 (2012).
- Marder, E., Calabrese, R. L. Principles of rhythmic motor pattern generation. Physiol rev. 76 (3), 687 (1996).
- Mullins, O. J., Hackett, J. T., Buchanan, J. T., Friesen, W. O. Neuronal control of swimming behavior: Comparison of vertebrate and invertebrate model systems. Prog Neurobiol. 93 (2), 244-269 (2011).
- Ohyama, T., et al. A multilevel multimodal circuit enhances action selection in Drosophila. Nature. 520 (7549), 633-639 (2015).
- Landgraf, M., Thor, S. Development of Drosophila motoneurons: specification and morphology. Semin cell devl bio. 17 (1), 3-11 (2006).
- Heckscher, E. S., et al. Even-Skipped(+) Interneurons Are Core Components of a Sensorimotor Circuit that Maintains Left-Right Symmetric Muscle Contraction Amplitude. Neuron. 88 (2), 1-16 (2015).
- Green, C. H., Burnet, B., Connolly, K. J. Organization and patterns of inter-and intraspecific variation in the behaviour of Drosophila larvae. Anim Behav. 31 (1), 282-291 (1983).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. Rover/Sitter Drosophila melanogaster Larval Foraging Polymorphism as a Function of Larval Development, Food-Patch Quality, and Starvation. J Insect Behav. 2 (3), 301-313 (1989).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
- Rebay, I., Rubin, G. M. Yan Functions as a General Inhibitor of Differentiation and Is Negatively Regulated by Activation of the Rasl / MAPK Pathway. Cell. 81 (6), 857-866 (1995).
- Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Tufte, E. R. . The visual display of quantitative information. , (2004).
