Utilizzando canali lineari Agarose per studiare<em> Drosophila</em> Comportamento larvale Crawling
Summary
La larva di Drosophila è un sistema potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento. Questa pubblicazione descrive l'utilizzo di canali di agarosio lineari per suscitare attacchi sostenuti di scansione e metodi lineari per quantificare la dinamica di strutture larvali durante comportamento strisciare ripetitivo.
Abstract
Drosophila scansione larvale sta emergendo come un potente modello per studiare il controllo neurale del comportamento sensomotorio. Tuttavia, il comportamento scansione larvale su superfici piane aperte è complessa, tra cui: pausa, tornitura, e meandri. Questa complessità nel repertorio di movimento ostacola un'analisi dettagliata degli eventi che si verificano nel corso di un singolo ciclo di scansione passo. Per superare questo ostacolo, i canali di agarosio lineari sono stati fatti che vincolano il comportamento larvale a diritto, sostenuta, scansione ritmica. In linea di principio, perché i canali di agarosio e il corpo larvale Drosophila sono sia otticamente trasparente, il movimento delle strutture larvali etichettati da sonde fluorescenti geneticamente codificati può essere monitorato in intatto, larve liberamente muoversi. In passato, le larve sono stati inseriti in scanalature lineari e strisciando a livello di tutto l'organismo, segmento e muscoli sono stati analizzati 1. In futuro, larve strisciando nei canali può essere utilizzato per l'imaging del calcio per il monitoraggio neurol'attività finale. Inoltre, questi metodi possono essere utilizzati con larve di ogni genotipo e con qualsiasi canale ricercatore progettato. Così il protocollo presentato sotto è ampiamente applicabile per gli studi che utilizzano la larva di Drosophila come modello per capire il controllo del motore.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare Drosophila scansione larvale in dettaglio. Esperimenti su locomozione hanno giocato un ruolo importante nello sviluppare e testare le teorie sul controllo motore 2. Tradizionalmente locomozione è stata studiata in animali acquatici (ad esempio, sanguisuga, lampreda, girino) 3. La natura ripetitiva di locomozione in questi animali ha consentito per lo studio di rhythmogenesis, per l'analisi degli eventi biofisici locomozione di guida, e per monitorare i modelli di cottura neurali che accompagnano locomozione.
L'uso di Drosophila larve per studi di locomozione presenta una combinazione unica di vantaggi rispetto ad altri sistemi modello: genetica facili, sviluppo ben caratterizzato, un corpo che è otticamente chiaro primi e secondi stadi, e un elettrone trasmissione permanente ricostruzione microscopica dell'intero sistema nervoso 4-6. Tuttavia, Drosophila larvale locomovimento su superfici piane aperte è un po 'complesso che include le pause, si gira, e serpeggiante striscia 7. Questa pubblicazione presenta un metodo per utilizzare i canali di agarosio lineari per guidare Drosophila comportamento motorio larvale in modo tale che le larve perform sostenuto, dritto, il comportamento scansione ritmica.
Studiando Drosophila comportamento larvale nei canali di agarosio, invece di comportamento su superfici piane aperte, ha diversi vantaggi. In primo luogo, permette ai ricercatori di selezionare specificamente strisciando comportamento dai molti movimenti che sono parte del repertorio comportamentale larvale. In secondo luogo, regolando la larghezza del canale rispetto alla dimensione del corpo larvale, velocità scansione può essere regolata. Terzo, canali consentono la larva per essere visto da dorsale, ventrale o laterale a seconda di come la larva viene caricato e orientato all'interno del canale. Questa versatilità in orientamento larvale permette a qualsiasi struttura di interesse per essere costantemente visibile durante la scansione. Il quarto,canali sono suscettibili per l'uso con un'ampia varietà di microscopi e obiettivi. Ad esempio, canali lineari possono essere utilizzati per l'imaging bassa risoluzione sulla stereoscopes campo chiaro e / o per l'imaging ad alta risoluzione sulla filatura-disco microscopio confocale 1. Quinto, questo metodo può essere usato in combinazione con optogenetic / thermogenetic manipolazioni neuronali in qualsiasi sfondo genetico. Infine, perché sia il corpo larvale (in prima e seconda stadi) e canali di agarosio sono otticamente trasparente, canali possono essere utilizzati quando si studiano i movimenti dinamici, o cambiamenti di intensità fluorescente delle strutture larvali etichettati da sonde fluorescenti geneticamente codificati.
Il metodo descritto è adatto per gli studi cinematici dettagliati di primo e secondo instar Drosophila comportamento larvale. Questa pubblicazione analizza i cambiamenti dinamici di intensità fluorescente del sistema nervoso centrale durante la scansione larvale in avanti per dimostrare l'utilizzo di canali e come un precursore di NeuCalcio Imaging Ronal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un dispositivo di microfluidica è stato costruito per rendere i canali di agarosio lineari che possono ospitare larve di Drosophila (Figura 1). Quando Drosophila larve sono collocati in questi canali agarosio lineari loro repertorio comportamentale è limitato a scansione, che consente l'osservazione dettagliata della dinamica di strutture larvali durante il ciclo di scansione.
Una registrazione riuscita si verifica quando una larva eseguire una serie …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Chris Wreden and Michelle Bland for comments on the manuscript and for technical help.
Materials
| 6 oz square Drosophila bottle | Scimart | DR-103 | |
| agar | sigma | A1296 | |
| sucrose | sigma | S9378 | |
| apple juice | not from concentrate | ||
| Tegosept | Fisher | T2300 | methyl-p-hydroxybenzoate |
| 35 x 10 mm round petri dish | Fisher | 351008 | |
| baker's yeast | |||
| PDMS casting mold | FlowJem | can be requested from authors | |
| isopropyl alcohol | Fisher | A417-1 | |
| laboratory wipes | Fisher | 06-666-11 | |
| canned air | Fisher | 18-431 | |
| 10 cm petri dish | BioPioneer | GS82-1473-001 | |
| agarose | Fisher | 50-444-176 | |
| razor blade | Fisher | 12-640 | |
| forceps | FST | 11241-40 | |
| 22 x 40 cover glass, #1.5 | Fisher | 50-365-605 | |
| Fiji (version 1.51d) | NIH | fiji.sc | |
| Excel 2016 | Microsoft | www.microsoftstore.com | |
| MATLAB R2016 | Mathworks | www.mathworks.com |
References
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