Identificatie van vetzuren in<em> Bacillus cereus</em
Summary
We propose a protocol to identify fatty acids without the need to purify them. It combines information on the retention times with the mass spectra of three types of fatty acid derivatives: fatty acid methyl esters (FAMEs), 4,4-dimethyl oxazoline derivatives (DMOX), and 3-pyridylcarbinyl esters (picolinyl).
Abstract
Bacillus species bevatten vertakte keten en onverzadigde vetzuren (FA's) met verschillende posities van de methylvertakking (iso- of anteiso) en de dubbele binding. Veranderingen in FA samenstelling spelen een cruciale rol in de aanpassing van bacteriën aan hun omgeving. Deze veranderingen leiden tot een verandering in de verhouding van iso versus anteiso vertakte FA, en in de hoeveelheid onverzadigde FA opzichte van verzadigde FA's met dubbele bindingen gemaakt op specifieke posities. Nauwkeurige beschrijving van de FA profiel moet de aanpassingsmechanismen van Bacillus species begrijpen.
Veel van de FA van Bacillus zijn niet commercieel beschikbaar. De hierin voorgestelde strategie identificeert FA's door het combineren van informatie over de retentietijd (door berekening van de equivalente ketenlengte (ECL)) met de massa spectra van drie soorten FA derivaten: vetzuurmethylesters (FAME), 4,4-dimethyl oxazoline derivaten (DMOX), en3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl). Deze methode kan de FA identificeren zonder de noodzaak om de onbekende FA zuiveren.
Vergelijking chromatografische profielen van FAME bereid uit Bacillus cereus met een commercieel mengsel van standaarden maakt de identificatie uit onvertakte verzadigde FA's, de berekening van de ECL en hypotheses over de identiteit van de andere FA. FAME vertakte verzadigde FA's, iso- of anteiso, vertonen een constante negatieve verschuiving in de ECL, vergeleken met lineaire verzadigde FA's met hetzelfde aantal koolstofatomen. FAME onverzadigde FA kan worden gedetecteerd door de massa van de moleculaire ionen en leiden tot een positieve verandering in de ECL vergeleken met de overeenkomstige verzadigde FA's.
De vertakking positie van FA en de dubbele binding positie van onverzadigde FA kan worden geïdentificeerd door het elektron ionisatie massaspectra van picolinyl en DMOX derivaten, respectievelijk. Deze benadering identificeert alle onbekende verzadigde taked FA, onverzadigde rechte keten FA en onverzadigde vertakte FA uit de B. cereus extract.
Introduction
Vetzure methylester (FAME) gaschromatografie (GC) is een belangrijke methode voor lipide karakterisering. Al snel scheidt en kwantificeert de verschillende vetzuren (FA) van een monster na een korte extractiestap. Derivaten van methylesters zijn zeer volatiel, stabiel en inert ten opzichte van de chromatografiekolom, waardoor pieken met staarten vermeden. Hun identificatie is vrij eenvoudig als het monster uit bekende FA omdat de chromatografische profielen ofwel gepubliceerd of in vergelijking met de normen. Bovendien wordt de herhaalde injectie van kalibratiestandaarden voor het kwantificeren van verschillende FA niet vereist, gezien hun nagenoeg constant reactie op vlamionisatiedetectie (FID) 1.
Naast FID, massaspectrometrie (MS) detectie levert een reeks aanvullende informatie FAME bevestigen. Echter, wanneer FAME's worden opgeladen met behulp van electron ionisatie (EI), de resulterende spectra niet altijd mogelijk voor the identificatie van FA fijne structuur. Bijvoorbeeld, vertakking positie (dat wil zeggen een vertakte methylgroep) is moeilijk te voorspellen, omdat de diagnostische ionen zijn moeilijk op te sporen 1 en Karakteristiek doelion overvloed machine-afhankelijk, die het gebruik van massaspectra bibliotheken 2. Een andere uitdaging ligt in het identificeren van de dubbele binding positie, omdat EI veroorzaakt dubbele binding migratie. Zo kan FA isomeren met verschillende dubbele binding posities niet worden onderscheiden door hun massa spectra. Gelukkig zijn andere instrumenten ontwikkeld voor FA identificatie. Zo kan de aanwezigheid en de positie van vertakking of dubbele bindingen in FA worden gegist door berekening van de equivalente ketenlengte (ECL) 3.
Derivatisering andere methoden resulteren in verschillende massaspectra, afhankelijk van de plaats van een dubbele binding of een vertakte methylgroep. 4,4-dimethyl oxazoline derivaten (DMOX) 4 zorgen voor EASy identificatie van de plaats van enkelvoudig onverzadigde vetzuren dubbele bindingen. 3-pyridylcarbinyl ester (picolinyl ester) derivaten zorgen voor de ondubbelzinnige identificatie van de locatie van methylvertakte FA 5. Combineren chromatografische (ECL) en massaspectra (DMOX en picolinyl) informatie kan bij de identificatie van de meeste FA zonder dat ingewikkelde zuiveringsmethoden gebruikt, zoals vereist voor kernspinresonantie (NMR) spectrum, het onbetwistbaar werkwijze voor structuurkarakterisering 1 .
Bacteriën van het genus Bacillus, die een aantal menselijke en dierlijke pathogenen omvatten, kunnen zeer divers niches koloniseren en worden daarom op grote schaal in het milieu 6. Onder het geslacht Bacillus, wordt FA vorm beïnvloed door de ecologische niche van de diersoorten die modulaties in FA patronen aan te passen aan uiteenlopende omgevingsveranderingen (bijvoorbeeld groeimedium, temperatuur,pH, etc.) 7-9. Vanwege de relatieve homogeniteit van de FA patroon over species van het genus Bacillus tijdens de groei in gestandaardiseerde omstandigheden bepaling FA samenstelling is één van de belangrijkste criteria voor de Bacillus species definiëren. Een unieke eigenschap van de Bacillus genus is de overvloed van vertakte FA's met 12-17 koolstoffen 10-12 met de verhouding tussen iso en anteiso isomeren als een belangrijke determinant van de aanpassing aan de milieu-omstandigheden. Bacillus species tevens aan aan omgevingschommelingen door het veranderen van de hoeveelheid onverzadigde vetzuren. In sommige species, zoals Bacillus cereus, twee vetzuurdesaturasen maken dubbele bindingen in verschillende posities van de alkylketen 13 verschillende rollen in aanpassing 9. Het voorbeeld van de Bacillus genus illustreert het belang van de dubbele binding positie nauwkeurig identificeren en FA vertakking. Verzamelensluitend, de identificatie van Bacillus FA patronen heeft verschillende nuttige toepassingen. Hierin stellen we een nieuwe GC-MS benadering voor Bacillus FA patroonidentificatie dat de inherente beperkingen van een klassieke GC-MS analyse overwint.
Deze innovatieve benadering kan direct worden gebruikt op ruw biologisch materiaal, en bestaat uit een combinatie van bestaande technieken: gegevens over retentietijden (ECL) en massaspectra van verschillende FA derivaten (FAME, DMOX en picolinyl-ester).
We gebruiken de volgende FA nomenclatuur. i, een en n geven iso, anteiso methylgroep vertakt en onvertakt vetzuur, respectievelijk. Onverzadigde FA werden genoemd door C: d waarin C het aantal koolstofatomen in het vetzuur en d is het aantal dubbele bindingen. Δ x de positie van de dubbele binding, waarbij de dubbele binding zich op de xe koolstof-koolstofbinding, vanaf de carbonzuureindgroep.
Protocol
Representative Results
Discussion
De FA chromatogramprofielen getoond in Tabel 1 komen overeen met B. cereus ATCC 14579 gekweekt op een agarplaat oppervlak. Soortgelijke profielen werden verkregen wanneer de bacterie in beluchte vloeibare medium werd gekweekt bij dezelfde temperatuur 8. Voor bacteriën gekweekt in vloeibare media, is de bacteriële biomassa door centrifugeren van het kweekmedium en kan worden gewassen volgens de eerder beschreven protocollen afhankelijk van de groeiomstandigheden 8,19. De …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs zijn dankbaar voor Thomas Mison voor zijn technische ondersteuning, en Rachel Kopec voor de herziening van het manuscript.
Materials
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| capillary column ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m x 0.25mm x 0.25µm |
| Methanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| potassium hydroxide | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichloromethane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| potassium tertiobutoxide | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-methyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Bacterial Acid Methyl Ester (BAME) Mix | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
References
- Christie, W. W., Han, X. . Lipid Analysis 4th Edition. , (2010).
- HÜbschmann, H. -. J. . Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , (2015).
- Sasser, M. Identification of Bacteria by Gas Chromatography of Cellular Fatty Acids. MIDI Technical note. 101, 1-6 (1990).
- Spitzer, V. Structure analysis of fatty acids by gas chromatography – Low resolution electron impact mass spectrometry of their 4,4-dimethyloxazoline derivatives – A review. Prog Lipid Res. 35 (4), 387-408 (1996).
- Harvey, D. J., Christie, W. W. . Advances in lipid methodology. Volume 1. , 19-80 (1992).
- Diomande, S. E., Nguyen-The, C., Guinebretière, M. -. H., Broussolle, V., Brillard, J. Role of fatty acids in Bacillus environmental adaptation. Front Microbiol. 6, (2015).
- Brillard, J., et al. Identification of Bacillus cereus Genes Specifically Expressed during Growth at Low Temperatures. Appl Environ Microbiol. 76 (8), 2562-2573 (2010).
- de Sarrau, B., et al. Influence of Anaerobiosis and Low Temperature on Bacillus cereus Growth, Metabolism, and Membrane Properties. Appl Environ Microbiol. 78 (6), 1715-1723 (2012).
- Diomandé, S. E., et al. Involvement of the CasK/R two-component system in optimal unsaturation of the Bacillus cereus fatty acids during low-temperature growth. Int J Food Microbiol. 213, 110-117 (2015).
- Berkeley, R. C. W., Heyndrickx, M., Logan, N., De Vos, P., Berkeley, R. C. W. . Applications and Systematics of Bacillus and Relatives. , 1-7 (2002).
- Kämpfer, P. Limits and Possibilities of Total Fatty Acid Analysis for Classification and Identification of Bacillus Species. System. Appl. Microbiol. 17 (1), 86-98 (1994).
- Kaneda, T. Fatty-acids of genus bacillus – example of branched-chain preference. Bacteriol Rev. 41 (2), 391-418 (1977).
- Chazarreta Cifre, L., Alemany, M., de Mendoza, D., Altabe, S. Exploring the Biosynthesis of Unsaturated Fatty Acids in Bacillus cereus ATCC 14579 and Functional Characterization of Novel Acyl-Lipid Desaturases. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6271-6279 (2013).
- Sasser, M., et al. Identification of Bacillus anthracis from culture using gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters. J AOAC Int. 88 (1), 178-181 (2005).
- Schutter, M. E., Dick, R. P. Comparison of fatty acid methyl ester (FAME) methods for characterizing microbial communities. Soil Sci Soc Am J. 64 (5), 1659-1668 (2000).
- Destaillats, F., Angers, P. One-step methodology for the synthesis of FA picolinyl esters from intact lipids. J Am Oil Chem Soc. 79 (3), 253-256 (2002).
- Fay, L., Richli, U. Location of double-bonds in polyunsaturated fatty-acids by gas-chromatography mass-spectrometry after 4,4-dimethyloxazoline derivatization. J Chromatogr. 541 (1-2), 89-98 (1991).
- Zhang, J. Y., Yu, Q. T., Liu, B. N., Huang, Z. H. Chemical modification in mass spectrometry IV-2-alkenyl-4,4-dimethyloxazolines as derivatives for the double bond location of long-chain olefinic acids. Biol Mass Spect. 15 (1), 33-44 (1988).
- de Sarrau, B., et al. Unsaturated fatty acids from food and in the growth medium improve growth of Bacillus cereus under cold and anaerobic conditions. Food Microbiol. 36 (2), 113-122 (2013).
- Miwa, T. K., Mikolajczak, K. L., Earle, F. R., Wolff, I. A. Gas chromatographic characterization of fatty acids.Identification constants for mono- and dicarboxylic methyl esters. Anal Chem. 32 (13), 1739-1742 (1960).
- van Den Dool, H., Kratz, P. A generalization of the retention index system including linear temperature programmed gas-liquid partition chromatography. J Chromatogr A. 11, 463-471 (1963).
- Stransky, K., Jursik, T., Vitek, A. Standard equivalent chain length values of monoenic and polyenic (methylene interrupted) fatty acids. J High Res Chromatogr. 20 (3), 143-158 (1997).
