Nous proposons un protocole permettant d’identifier les acides gras sans avoir besoin de les purifier. Il combine des informations sur les temps de rétention avec les spectres de masse de trois types de dérivés d’acides gras : les esters méthyliques d’acides gras (FAME), les dérivés de 4,4-diméthyloxazoline (DMOX) et les esters de 3-pyridylcarbinyle (picolinyl).
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Les espèces de Bacillus contiennent la chaîne et des acides gras insaturés (AF) ramifiés avec des positions diverses de la branche de méthyle (iso ou anteiso) et de la double liaison. Changements dans la composition FA jouent un rôle crucial dans l'adaptation des bactéries à leur environnement. Ces modifications entraînent un changement dans le rapport des iso contre anteiso ramifié AF, et la proportion de insaturée AF par rapport à saturé AF, avec des doubles liaisons créées à des positions spécifiques. L' identification précise du profil FA est nécessaire de comprendre les mécanismes d'adaptation des espèces de Bacillus.
Bon nombre des AF de Bacillus ne sont pas disponibles dans le commerce. La stratégie proposée ici identifie AC en combinant des informations sur le temps de rétention (par le calcul de la longueur de chaîne équivalente (ECL)) avec les spectres de masse des trois types de dérivés FA: des esters méthyliques d'acides gras (FAME), 4,4-diméthyl oxazoline dérivés (DMOX), etester 3-pyridylcarbinyl (picolinyle). Cette méthode permet d'identifier les AF sans la nécessité de purifier l'inconnu AF.
En comparant les profils chromatographiques de FAME préparé à partir de Bacillus cereus avec un mélange commercial de normes permet l'identification de chaîne droite saturée AF, le calcul de la ECL, et les hypothèses sur l'identité de l'autre AF. FAME de ramifiés saturés AF, iso ou anteiso, afficher un décalage négatif constant dans la ECL, contre linéaires saturés avec AF le même nombre de carbones. FAME de insaturée AF peuvent être détectés par la masse de leurs ions moléculaires, et se traduisent par un changement positif dans la ECL par rapport aux AF saturés correspondants.
La position de branchement des AF et la position de double liaison insaturée d'AF peuvent être identifiés par l'ionisation d'électrons spectres de masse des picolinyle et DMOX dérivés, respectivement. Cette approche identifie toutes les branches saturée inconnueed AF, insaturé linéaire AF et AF ramifiés insaturés de l'extrait B. cereus.
Introduction
l'acide gras Chromatographie ester méthylique (FAME) de gaz (GC) est une méthode essentielle pour la caractérisation des lipides. Il se sépare rapidement et quantifie les différents acides gras (AF) d'un échantillon après une courte étape d'extraction. Les produits dérivés d'esters méthyliques sont très volatils, stable et inerte vers la colonne chromatographique, ce qui évite des pics de résidus. Leur identification est assez simple lorsque l'échantillon est constitué d'AF bien connus parce que les profils chromatographiques sont soit publiés ou par rapport aux normes. En outre, l'injection répétée de normes d'étalonnage pour la quant....
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Protocole
1. Cultures bactériennes
- Préparer une pelouse des bactéries (Bacillus cereus souche ATCC 14579) en étalant 100 ul d'une culture de nuit de la souche en incubation à 30 ° C dans du milieu LB (milieu Luria-Bertani), sur la surface d'une plaque de milieu LB gélose. Incuber la plaque pendant une nuit à 30 ° C.
2. ECL: chaîne Longueur équivalente
- Calculer ECL comme suit:
avec:
i, le soluté d'intérêt;
n, le nombre de carbone de l'ester méthylique de la chaîne d'acides gras sa....
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Résultats
La stratégie d'identification des cellules bactériennes FA est présenté sur la figure 1. Chaque étape fournit des informations ou des informations sur la rétention chromatographique spectrale complémentaire. L'étape 1 consiste d'identification FA préliminaire en utilisant une solution standard. Étape 2 permet l'interprétation des spectres EI FAME et de leur ECL, afin d'identifier provisoirement les produits. Étape 3 identifie l'emplacement de bran.......
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Discussion
Les profils chromatographiques FAs présentés dans le tableau 1 correspondent à B. cereus ATCC 14579 cultivée sur une surface de la plaque de gélose. Des profils similaires ont été obtenus lorsque la bactérie a été cultivée dans un milieu liquide aéré à la même température 8. Dans le cas des bactéries cultivées en milieu liquide, la biomasse bactérienne est recueillie par centrifugation du milieu de croissance et peut être lavée selon des protocoles décrits précédemment en fonction de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants à Thomas Mison pour son soutien technique, et de Rachel Kopec pour la révision du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| GC/MS | Shimadzu | QP2010 | |
| colonne capillaire ZB WAX | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30 m x 0,25 mm x 0,25 et micro ; m |
| Méthanol Lichrosolv | VWR | 1.06018.2500 | |
| hydroxyde de potassium | Aldrich | P1767 | |
| THF | Hipersolv Chromanorm | 28559.320 | |
| Dichlorométhane | Hipersolv Chromanorm | 23373.320 | |
| Hexane | Hipersolv Chromanorm | 24575.320 | |
| 3-pyridinemethanol | Aldrich | P6-680-7 | |
| tertiobutoxyde de potassium | Aldrich | 156671 | |
| 2-amino-2-méthyl-1-propanol | A-9879 | ||
| MilliQ Academic | Millipore | ZMQS50001 | |
| Mélange d’ester méthylique acide bactérien (BAME) | Sigma-Aldrich | 47080-U Supelco |
Références
- Christie, W. W., Han, X. Lipid Analysis 4th Edition. , Oily press. (2010).
- HÜbschmann, H. -J. Handbook of GC-MS: fundamental and application. Third edition. , Wiley-vch. (2015).
- Sasser, M.
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Réimpressions et autorisations
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