Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression
Summary
Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.
Abstract
Nella malattia di Parkinson (PD) non vi è perdita neuronale diffusa in tutto il cervello con degenerazione dei neuroni dopaminergici pronunciata nel snc, che porta a bradicinesia, rigidità, e tremore. L'identificazione dei neuroni dopaminergici che vivono in colture primarie ventrale mesencefalica (VM) utilizzando un marcatore fluorescente fornisce un modo alternativo per studiare la vulnerabilità selettiva di questi neuroni senza fare affidamento sul immunocolorazione delle cellule fissate. Qui, isolare, dissociamo, e la cultura di topo neuroni VM per 3 settimane. Abbiamo poi identifichiamo neuroni dopaminergici nella coltura usando eGFP fluorescenza (guidata da un promotore tirosina idrossilasi (TH)). neuroni individuali sono raccolte in provette da microcentrifuga utilizzando micropipette di vetro. Successivamente, abbiamo la lisi delle cellule raccolte, e condurre la sintesi del DNA e trasposoni-mediata "tagmentation" per produrre librerie di RNA-Seq singola cella 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Dopo aver superato un controllo di qualità-controllo, librerie unicellulari sono in sequenza e la successiva analisi viene effettuata per misurare l'espressione genica. Riportiamo i risultati trascrittoma per dopaminergici individuale e neuroni GABAergici isolati da colture mesencefalo. Si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che sono stati raccolti e sequenziati erano neuroni dopaminergici. Queste tecniche avranno applicazioni diffuse nel campo delle neuroscienze e della biologia molecolare.
Introduction
La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa incurabile, legate all'età. La causa di questo disturbo relativamente comune rimane poco compresa. Vi è diffusa perdita neuronale in tutto il cervello, con marcata degenerazione neuronale dei neuroni dopaminergici nella sostanza nera (SNC), che porta a caratteristiche cliniche diagnostiche di bradicinesia, rigidità e tremori.
colture miste primarie contenenti neuroni dopaminergici SNC sono particolarmente rilevanti per la malattia di Parkinson. Ventrale tegmentale Area (VTA) neuroni dopaminergici sono stati implicati nella ricompensa e la dipendenza. Ventrale mesencefalico (VM) colture primarie embrionali miste contengono sia i neuroni SnC e VTA dopaminergici (DA) e neuroni GABAergici. VM colture primarie possono essere utili per saggi neuroprotezione e per chiarire la vulnerabilità selettiva dei neuroni dopaminergici. Non vi è alcun modo affidabile per identificare le cellule dopaminergiche in coltura basati sulla morfologia. luire sviluppiamo tecniche per identificare e raccogliere i neuroni dopaminergici singoli, e costruire unicellulari, ad alto rendimento librerie RNA di sequenziamento.
Riportiamo i dati rappresentativi RNA trascrittoma per singola dopaminergici e neuroni GABAergici isolati da colture mesencefalo. Questo protocollo può essere utilizzato per la neuroprotezione, neurodegenerazione, e saggi farmacologici per studiare gli effetti dei vari trattamenti sul trascrittoma DA / GABA. Perché neuroni dopaminergici rappresentano una piccola minoranza dei neuroni espresse in colture primarie VM, la capacità di identificare in modo affidabile questi neuroni in culture che vivono consentirà una maggiore gamma di studi unicellulari. Queste nuove tecniche faciliteranno progressi nella comprensione dei meccanismi che si svolgono a livello cellulare e possono avere applicazioni altrove nel campo delle neuroscienze e della biologia molecolare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si isolare le cellule singole da una popolazione eterogenea con un tag fluorescenti, quindi studiare ogni cella con cella singola RNA-Seq. Si segnala che il 100% delle cellule vive TH-eGFP che abbiamo raccolto e sequenziati erano neuroni dopaminergici infatti, basata sulla presenza delle seguenti tre trascritti genici DA-correlati, TH, DDC e slc6a3. Tutte le cellule positive TH-eGFP espresso questi tre geni come valutato dal RNA-Seq. Questo è stato concorde con gli studi elettrofisiologici che hanno dimostrato che …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the U.S. National Institutes of Health (DA017279, AG033954, DA037743), the Michael J. Fox Foundation, and the Caltech Innovation Initiative funding the Millard and Muriel Jacobs Genetics and Genomics Laboratory at the California Institute of Technology. We thank Brian Williams for optimising the RNA-Seq library protocol and for providing assistance. We thank Henry Amrhein for computational training. We thank Barbara J. Wold for the use of her equipment and laboratory space. We thank Igor Antoshechkin for library sequencing, and for facility management.
Materials
| Papain | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS), 1X | Gibco | 14175-095 | |
| Donor Equine Serum | Thermo Scientific | SH30074.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| Culture media that contains a stabilized form of L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM final concentration. |
| L-Ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50 X stock solution, 1 X final concentration. |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | Stored at -20°C in 20 µL aliquots |
| Deoxyribonuclease I (DNase) | Sigma | DN25 | |
| Blue pipette tips | Sorenson Bioscience, | Inc. 10130 | |
| P1000 | |||
| 10 mm shallow Petri dish | VWR | 25384-324 | |
| 37°C Water bath | |||
| 37°C, 5% humidity incubator | |||
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Donkey serum | Equitech | SD-0100HI | 100% stock solution, 1% final concentration. |
| Standard Pattern surgical scissors | Fine Science Tools | 14000-14 | |
| Forceps – 2×3 teeth | Fine Science Tools | 11022-14 | |
| Forceps – Dumont #55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
| 10X PBS, pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered solution (DPBS) 1X | Gibco | 14190-144 | 500 ml |
| 21 guage needle | BD PrecisionGlide Needle | 305167 | 100 needles |
| Micropipette puller | Sutter Instrument. | model P-87 | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Sequencing Kit: SMARTer Ultra Low RNA Kit for Illumina Sequencing | Clontech | 634936 | 100rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| oligonucleotide (12 µM): SMARTer IIA oligonucleotide (12 µM) | From the SMARTer Kit | ||
| Reverse transcriptase (100 units) | SMARTcribe reverse transcriptase | From the SMARTer Kit | |
| Primer 1 | 3’ CDSIIa primer | From the SMARTer Kit | |
| Primer 2 | IS PCR primer | From the SMARTer Kit | |
| 50X 2 polymerase mix | 50X Advantage 2 polymerase mix | From the SMARTer Kit | |
| 10X PCR buffer | 10X Advantage 2 PCR buffer | From the SMARTer Kit | |
| RNA Spikes | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCR cooler rack | IsoFreeze PCR cooler rack. | ||
| DNA Sample Preparation Kit | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 Samples |
| PCR master mix | Nextera PCR master mix (NPM) | From the Nextera Kit | |
| PCR primer cocktail (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) | From the Nextera Kit | |
| Fluorometer | The Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer kit | Agilent | 5067-4626 | 110rxns |
| Electrophoresis system | Agilent 2100 Bioanalyzer. | G2938C | |
| Magnetic beads: Agencourt AMPure | Beckman Coulter | A63880 | 5ml |
| RNAse wipe: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500 assays |
| Gel extraction kit: Qiaquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Glass capillary tubing | (Kimax-51, 1.5–1.8 mm o.d.) | ||
| Microforge | Narishige (or equivalent) | ||
| Sequencer | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP mouse strain | MMRRC stock number: 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
References
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