293T細胞の一過性トランスフェクションにより、複製欠損レトロウイルスの生産

Summary

この手法は、人間の癌遺伝子をコードし、その後マウスモデルにおける骨髄増殖性疾患の誘発に使用される。複製欠損レトロウイルス株を準備する効率的な方法を示します

Abstract

Bcr – Ablタンパクまたは成長因子受容体由来の癌遺伝子（ZNF198 – FGFR1、BCR -PDGFRα、等）などのがん遺伝子により誘導される私たちの研究室の研究は人間の骨髄増殖性疾患。我々は以前に興味の癌遺伝子を発現するレトロウイルスを感染させた骨髄細胞を移植することにより、私たちのマウスモデルにおける人間のような疾患をモデル化し、勉強することができます。複製欠損レトロウイルスは、ヒトの癌遺伝子をコードするとマーカー（GFP、RFP、抗生物質耐性遺伝子など）は、293T細胞を用いた一過性トランスフェクションプロトコル、アデノウイルスE1A遺伝子産物で形質転換ヒト腎上皮細胞株によって産生される。 293細胞は容易に達成可能な最大50-80％のトランスフェクション効率と、リン酸カルシウム（CAPO _4）による高transfectableという異常な性質を持っている。ここで、我々はそのような単一ゲノムのパッケージングは​​、プラスミドEcoPakこのケースでは、KATまたはPCLを構築する。のようなギャグ- POL – env​​の包装の機能を、表現する関心の癌遺伝子の発現レトロウイルスベクターとプラスミドとの293細胞トランスフェクションのCO最初のトランスフェクションは、さらにクロロキンの使用により改善される。エコトロピックウイルスの株は、培養上清48時間として収集。トランスフェクション後、-80℃で保存し、変換の観点及びin vitro試験セルの行、またはそのようなし私たちのマウスモデルで移植に使用できるマウスの骨髄細胞などの初代培養細胞の感染に使用することができる。

Protocol

変換前の夕方、3 × 10 6セル/ 6 cmの組織cultureplateでプレート293T細胞。 注：私たちは、トランスフェクションとefficacyasウイルス産生細胞の容易さのために293T細胞を使用する。ヘルパープラスミドが導入されていない限り、これらの細胞は、ウイルスのパッケージングに不足しています。 最初の朝、穏やかに培地を除去し、4ミリリットル293T細胞MEDは、25mMのクロロ?…

Discussion

4つの重要な点は良いのウイ​​ルス株の成功が保証されます。

1. 293T産生細胞は、それらは非常に定期的に分割されている意味、非常に健康的である必要は草に覆われたことはなかった、と彼らは密度に到達するように、6 cmの組織培養プレートあたり3.5から5000000の最適化された密度でプレーティングされていますプレートの80％のトランスフェクションの朝に。
   
2. セルlysozomesを安定化…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
293T cells	cell-line			Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well.
293T cell medium				DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro.
coding DNA plasmid				Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.)
EcoPak				also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env
2x HBS				For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight.
2M CaCl2		Sigma
miliQ H2O				sterile-filtered
Chloroquine				1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed.
6 cm plates				for tissue culture
Incubator				for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2.
10 cc sterile syringes				Sterile. One per virus type.
18G needles				single use, one per virus type.
45 um syringe filters
5 ml plastic tubes				Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes.
50 ml conical tubes
cryovials				2 and 4 ml, for virus aliquots.

All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl₂, 2x HBS, miliQ H₂O) and kept sterile.