Deze techniek laat een efficiënte manier om replicatie-defecte retrovirale aandelen dat codeert voor een menselijk oncogen voor te bereiden, en vervolgens gebruikt voor de inductie van myeloproliferatieve ziekte in de muis model.
Ons laboratorium onderzoek naar menselijke myeloproliferatieve ziekten veroorzaakt door dergelijke oncogenen als Bcr-Abl of groeifactor receptor-afgeleide oncogenen (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.). We zijn in staat om het model en een mens-achtige ziekte te bestuderen in ons muismodel, door het transplanteren van beenmergcellen die eerder geïnfecteerd met een retrovirus uiting van de oncogen van belang. Replicatie-defecte retrovirus dat codeert voor een menselijk oncogen en een marker (GFP, RFP, antibiotica-resistentie-gen, enz.) wordt geproduceerd door een transiënte transfectie protocol met behulp van 293T-cellen, een menselijke nier epitheel cellijn getransformeerd door het adenovirus E1A genproduct. 293 cellen hebben de bijzondere eigenschap dat zeer transfectable door calciumfosfaat (Capo 4), met maximaal 50-80% transfectie-efficiëntie gemakkelijk haalbaar. Hier hebben we co-transfecteren 293 cellen met een retrovirale vector uiting van de oncogen van belang en een plasmide die de gag-pol-env verpakking functies, zoals de single-genoom verpakking kat of PCL, bouwt in dit geval de Ecopak plasmide uitdrukt. De initiële transfectie wordt verder verbeterd door het gebruik van chloroquine. Voorraden ecotropic virus, verzameld als cultuur supernatant 48 uur. post-transfectie, kunnen worden opgeslagen bij -80 ° C en worden gebruikt voor infectie van cel-lijnen in het licht van transformatie en in vitro studies, of primaire cellen zoals beenmergcellen van de muis, die vervolgens kunnen voor transplantatie worden gebruikt in ons muismodel .
Vier kritieke punten zullen verzekeren het succes van een goede viral voorraad:
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
2M CaCl2 | Sigma | |||
miliQ H2O | sterile-filtered | |||
Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
6 cm plates | for tissue culture | |||
Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
18G needles | single use, one per virus type. | |||
45 um syringe filters | ||||
5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
50 ml conical tubes | ||||
cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. |
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile.