Esta técnica demonstra uma forma eficiente de preparar replicação defeituosa stocks retroviral codificação de um oncogene humano, e posteriormente utilizado para indução de doença mieloproliferativa no modelo de mouse.
Nossos estudos de laboratório humano doenças mieloproliferativas induzidas por oncogenes, como Bcr-Abl ou receptor do fator de crescimento derivado de oncogenes (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα, etc.) Somos capazes de modelo e estudo de doenças humanas-como em nosso modelo de mouse, através do transplante de células da medula óssea previamente infectadas com um retrovírus expressando o oncogene de interesse. Replicação defeituosa retrovírus codificação de um oncogene humano e um marcador (GFP, RFP, o gene de resistência a antibióticos, etc) é produzido por um protocolo de transfecção transiente usando células 293T, uma linha celular humana renal epiteliais transformadas pelo produto do gene E1A do adenovírus. 293 células têm a propriedade incomum de ser altamente transfectable por fosfato de cálcio (CAPO 4), com até 50-80% de eficiência de transfecção prontamente atingível. Aqui, nós co-transfecção 293 células com um vetor retroviral expressando o oncogene de interesse e um plasmídeo que expressa as funções gag-pol-env embalagens, tais como o genoma de um único embalagem constrói kat ou PCL, neste caso, o Ecopak plasmídeo. A transfecção inicial é melhorada pelo uso da cloroquina. Estoques de vírus ecotropic, coletados como cultura sobrenadante de 48 horas. pós-transfecção, podem ser armazenadas a -80 ° C e utilizado para a infecção de células-lines em vista da transformação e estudos in vitro, ou pilhas como as células da medula óssea do rato, que pode então ser utilizada para transplante em nosso modelo de camundongo .
Quatro pontos críticos vai garantir o sucesso de um bom estoque viral:
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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293T cells | cell-line | Split 1:3 to 1:4 every 3 days, otherwise they will tend to clump with replating and will not transfect as well. | ||
293T cell medium | DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (1% NEAA, optional). We obtain our tissue culture slutions from CellGro. | |||
coding DNA plasmid | Twice purified by CsCl. MSCV backbone, encoding oncogene and marker of choice (Neo, GFP, etc.) | |||
EcoPak | also called pMCV-Ecopac: ecotropic packaging plasmid, encoding gag-pol-env | |||
2x HBS | For 500 ml: 8.0 g NaCl + 0.37 g KCl + 106.5 mg Na2HPO4 (anhydrous; 201.1 mg if 7xH2O) + 1.0 g dextrose (D-glucose) + 5.0 g HEPES powder. Dissolve in 450 ml dH2O (milli-Q), adjust pH to 7.05 with NaOH, then complete to 500 ml with dH2O. Sterile filter thru 0.45 µ filter. Store at room temperature, with the cap on tight. | |||
2M CaCl2 | Sigma | |||
miliQ H2O | sterile-filtered | |||
Chloroquine | 1000x stock is 25 mM in PBS- (w/o Ca2+/Mg2+), stored at -20C. Add fresh to the medium when needed. | |||
6 cm plates | for tissue culture | |||
Incubator | for tissue culture. Set at 37C, 10% CO2. | |||
10 cc sterile syringes | Sterile. One per virus type. | |||
18G needles | single use, one per virus type. | |||
45 um syringe filters | ||||
5 ml plastic tubes | Sterile, to mix transfection solution, for up to 2 plates at a time (2 ml). We use Falcon tubes. | |||
50 ml conical tubes | ||||
cryovials | 2 and 4 ml, for virus aliquots. |
All reagents used in the transfection must be sterile-filtered (CaCl2, 2x HBS, miliQ H2O) and kept sterile.