Summary

Het verzamelen van serum en Feeder-vrij muis embryonale stamcellen geconditioneerd medium voor een Cell-free Approach

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

Dit protocol verschaft een werkwijze voor het verzamelen van muis embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) verkregen uit serum (foetaal bovine serum, FBS) – en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) vrij voorwaarden voor een cel -gratis aanpak. Het kan dienstig voor de behandeling van veroudering en veroudering-geassocieerde ziekten.

Abstract

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Introduction

Het doel van dit protocol is om de muis te verzamelen embryonale stamcellen (mES) -geconditioneerd medium (mES-CM) van serum en feeder-vrije kweekomstandigheden en zijn biologische functies te karakteriseren.

In het algemeen zijn embryonale stamcellen (SER) hebben een groot potentieel voor regeneratieve geneeskunde en celtherapie als gevolg van hun pluripotentie en capaciteit voor zelf-vernieuwing 1-3. De directe transplantatie van stamcellen heeft verschillende beperkingen, zoals afstoting en tumorvorming 4,5. Daarom kan een cel-vrije benadering van een alternatieve therapeutische strategie voor de regeneratieve geneeskunde en veroudering interventies 6,7 bieden.

Senescence wordt gezien als een cellulaire tegenhanger van de veroudering van weefsels en organen, gekenmerkt door een permanente staat van groeistop, veranderde cel fysiologie en gedrag. Veroudering is de belangrijkste risicofactor voor voorkomende ziekten zoals kanker, hart- en vaatziekten, tYpe 2 diabetes, en neurodegeneratie 8. Een voor de hand liggende kenmerken van veroudering is de daling van het regeneratieve vermogen van weefsels, die wordt veroorzaakt door stamcellen veroudering en uitputting 9. Veel belangrijke studies farmacologische moleculen, zoals rapamycine 9, resveratrol 10 en metformine 11, bloed overgedragen systemische factoren, namelijk GDF11 12, dat het vermogen om consequent veroudering te vertragen en verlengt de levensduur te laten geven.

In de onderhavige studie werd mES-CM geoogst zonder serum (foetaal bovine serum, FBS) en feeder (muis embryonale fibroblasten MEF) lagen op de verontreiniging van serumfactoren en secretoire factoren uit MEFs sluiten. Deze voorwaarden zijn toegestaan ​​voor een serum en feeder-vrij CM dat bijgevolg kon de nauwkeurige identificatie van mES specifieke secretoire factoren.

Deze voorgestelde protocol is zeer efficiënt, relatief kosteneffectief en eenvoudigopereren. Deze techniek geeft inzicht in de karakterisering van mES-afgeleide oplosbare factoren die een anti-veroudering effect kan bemiddelen, die kunnen worden gebruikt voor de ontwikkeling van een veilig en potentieel voordelige celvrije therapeutische benadering van interventies voor veroudering geassocieerde ziekten en andere regeneratieve behandelingen.

Protocol

OPMERKING: Een schema van de serum- en voedingsvrije CM collectie protocol wordt weergegeven in figuur 1. 1. Materialen (Voorbereiding van de MEF, Medium, platen, en oplossingen) Bereid 500 ml van medium tot de cultuur van de MEF. Aangevuld Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% FBS (ESC kwaliteit), 50 eenheden / ml penicilline en 50 mg / ml streptomycine. Isoleer MEF uit embryo's na een vaste routine protocol 13 en te onderhouden in ME…

Representative Results

Oorspronkelijk worden mESCs bijgehouden op een MEF feeder in mES medium met FBS en andere supplementen (figuren 1A en 2A). CM werd verzameld mESCs verminderd serum medium zonder voedsterlaag, FBS of andere supplementen (figuren 1B en 2B). Deze cultuur voorwaarde stelt ons in staat om te verzamelen mES-specifieke geconditioneerd medium zonder mogelijke besmetting door de factoren uit de feeder, FBS of andere supplementen….

Discussion

Voor de succesvolle collectie van serum en feeder-free mES-CM, moeten de volgende suggesties in overweging worden genomen. De meest kritische factor is het gebruik van vroege passage mESCs voor het verzamelen van mES-CM. Eerder is aangetoond dat vroege passage mES-CM heeft betere anti-aging effect vergeleken met late passage mESCs. De passage aantal mESCs gemeld hun ontwikkelingspotentieel 16 en pluripotentie 17 beïnvloeden.

Terwijl aanvulling behoeft de bijzondere ken…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd gesteund door de Basic Science Research Program (2013R1A1A2060930) en de Medical Research Center Program (2015R1A5A2009124) door de National Research Foundation Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van Wetenschap, ICT, en Toekomst Planning. Dit onderzoek wordt ook ondersteund door een Start-up exploitatiesubsidie ​​van de Hospital for Sick Children (HK Sung). We willen graag Laura Barwell en Sarah JS Kim bedanken voor hun uitstekende hulp bij het bewerken van dit manuscript en Dr. Andras Nagy voor het verstrekken van de G4 mES lijn.

Materials

DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin  Invitrogen #15140 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto
-mycin.
L-glutamine  Invitrogen #25030 2mM
Nonessential amino acids (NEAA)  Invitrogen #11140 100uM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100uM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide  Aldrich #455946 5mM
potassium ferrocyanide  Aldrich #455989 5mM
NaCl  Sigma #S7653 150mM
MgCl Sigma #M2393 2mM
Mytomycin C  Sigma #M4287 10ug/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50ug/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter,  Corning #430513 0.2μm

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
Bae, Y., Sung, H., Kim, J. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

View Video