Wir präsentieren eine Open-Source hohe Content-Analyse (HCA) Instrument unter Verwendung von automatisierten Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) zur Untersuchung von Protein-Interaktionen mit Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basiert Ablesungen. Die Datenerfassung für dieses openFLIM-HCA Instrument wird von der Software in μManager geschrieben gesteuert und Datenanalyse wird in FLIMfit unternommen.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
Der zunehmende Einsatz von automatisierten Hoch Content – Analyse (HCA) in der Wirkstoffforschung 1 zu Testsubstanzbibliotheken wird von der Entwicklung der Life – Science – Grundlagenforschung in Richtung automatisierte Bildgebung Experimente für systematische Untersuchungen, zum Beispiel für die phänotypische Bildschirme von siRNA – Bibliotheken ergänzt. Automatisierte HCA wird immer wichtiger, auch für kleinere biologische Studien, die typischerweise mit Handversuche mit Zehn Gerichte von Zellen abgebildet mit herkömmlichen Mikroskopen umgesetzt wurden. Die statistische Aussagekraft durch die Fähigkeit verliehen Hunderte bis Tausende von Sichtfeldern ermöglicht experimentelle Rauschen (einschließlich "biologisches Rauschen") und die Automatisierung von Bilddatenerfassung und Analyse großer Probenarrays können Bediener Bias beseitigen und oft Lungs zu untersuchen und zu analysieren helfen kann verwendet werden, um das Auftreten von systematischen Fehlern, wie beispielsweise eine Änderung des IRF Profil während einer Akquisition zu erfassen. Fluoreszenz-basierte Assayssind weit verbreitet in HCA, mit den meisten handelsüblichen HCA Instrumentierung mit Fluoreszenzintensitätsabbildungs in einem oder mehreren spektralen Kanälen implementiert, um die relative Verteilung und Co-Lokalisierung von markierten Proteinen zuzuordnen. Anspruchsvollere Fluoreszenzbildgebungsmodalitäten, wie beispielsweise Fluoreszenz – Lebensdauer – Imaging (FLIM), Polarisationsanisotropie Bildgebung und zeitaufgelöste Fluoreszenz Anisotropie Bildgebung, sind nicht weit verbreitet in kommerziellen HCA Instrumente genutzt, obwohl sie leistungsfähige quantitative Ablesungen bieten, beispielsweise von Protein – Interaktionen. Hier präsentieren wir eine Open-Source-Ansatz FLIM in einem automatisierten Mikroskop für HCA zu implementieren.
Fluoreszenzlebensdauer liefert eine inhärent ratiometrisch spektroskopische Auslesung, die verwendet werden können unterschiedliche molekulare Spezies zu unterscheiden, oder die lokale molekulare Umgebung eines Fluorophors an die Sonde und ist unempfindlich gegen Fluorophorkonzentration zu Anregungs- / Nachweiseffizienzen, und auf die Auswirkungen der scatteRing und Probenaufnahme 2. Weiterhin kann, da der Fluoreszenzlebensdauer-Messungen in einem einzigen spektralen Kanal hergestellt werden, sind sie zwischen den verschiedenen Instrumenten und Proben ohne Kalibrierung direkt vergleichbar. Sie können auf endogene Fluorophore verwendet werden, einschließlich einiger zellulärer Metaboliten, Lipiden und extrazellulären Matrixkomponenten, intrinsische Auslesungen von biologischen Prozessen und Krankheiten bereitzustellen. So markierungsfreie FLIM kann metabolische Veränderungen in den Zellen 3,4 Karte und angewendet worden , um Stammzelldifferenzierung 5,6 und das Wachstum von Kollagen Gerüste 7 überwachen. Wir haben kürzlich gezeigt , dass FLIM HCA kann für die automatisierte markierungsfreien Assays des Zellstoffwechsels unter Verwendung von 8 Autofluoreszenz verwendet werden. Häufiger werden jedoch Fluoreszenzlebensdauer-Messungen und FLIM exogenen Fluorophoren angewendet, die spezifische Biomoleküle etikettieren, oft Farbstoffe implementiert, die zellulären Kompartimenten beflecken, gekoppelt Verwendung von Farbstoffen zu antibodies, die bestimmte Proteine in fixierten Zellen zielen, oder genetische Information Fluorophore an spezifische Proteine gekoppelt werden. Fluoreszenzlebensdauer kann verwendet werden, robust quantitative Ablesungen von Fluoreszenzsonden bereitzustellen ihrer physikalischen oder chemischen Umwelt Abfühlen. Für Beispiele sind Farbstoffe wurden eingesetzt , um die lokale Lipidphase der Zellmembranen 9 oder Zell Viskosität 10 und genetisch ausgedrückt fluoreszierendes Protein basierende Biosensoren entwickelt worden abzufühlen Konzentrationen von Zellmoleküle zu berichten Signalisierungs einschließlich wie IP3 11, PIP2 12 und Calpain 13 oder Ionen, wie Calcium 14,15, Kalium- und Chlorid – 16 17.
Viele solcher Biosensoren nutzen Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) 18,19 Auslesungen von Änderungen in der Konformation Biosensor bereitzustellen. FRET zwischen "Spender" und "Akzeptor" Fluorophore erfolgt über eine Nahbereichs direkte Dipol-Dipol-Wechselwirkung, für die Fluorophore werden typischerweise von weniger als ~ 10 nm getrennt sind. Somit ist die Detektion von FRET gibt die Nähe von entsprechend markierten Proteine und liefert daher ein Mittel , Protein-Protein – Wechselwirkungen 20 auszulesen, wie Bindung oder Oligomerisation – entweder als Endpunkte in fixierten Zellen oder als dynamische Ereignisse in Zeitverlaufsmessungen von lebendem Zellen. Durch Markierung eines geeigneten molekularen Konstruktes sowohl mit Donor- und Akzeptor – Fluorophore, ist es auch möglich , Konformationsänderungen auszulesen – oder Spaltung – des Konstrukts über die Veränderung in FRET und dies ist die Grundlage für viele Biosensoren 21. Messungen der FRET-Effizienz kann Information über den Abstand Donor-Akzeptor bereitzustellen und die Bevölkerungsanteil von Donor-Fluorophore unterzogen FRET. Somit kann FRET-basierte Bildgebungstechniken verwendet werden , um molekulare Wechselwirkungen in Raum und Zeit abzubilden und zu quantifizieren, beispielsweise Zellsignalprozesse 22 zu erläutern. Automating solche Abbildungstechniken könnten Assays mit hohem Durchsatz liefern basierend auf Ablesungen von Wegen oder Netzwerken zu signalisieren.
In HCA, die meisten der FRET Auslese üblicherweise implementiert ist spektrale ratiometrisch Bildgebung, wo Änderungen in dem Verhältnis von Akzeptor zu Donator Intensität zugeordnet sind. Während dieser Ansatz leicht implementiert ist – und in vielen handelsüblichen Multiwell – Plattenleser verfügbar ist – quantitative spektral aufgelöste FRET – Messungen erfordern eine Kalibrierung der spektralen Antwort des Systems 23. Dazu gehören spektrale Übersprechen aufgrund von spektralen Durchbluten und direkte Anregung des Akzeptors sowie die Übertragungseigenschaften des Instruments und der Probe (innere Filtereffekt). Im Prinzip bedeutet dies Messung von zusätzlichen "Kontrolle" Proben, die entweder mit Donor-Akzeptor nur oder nur für markiert sind.
Aus einer solchen spektralen ratiometrisch FRET – Messungen, eine wirksame FRETWirkungsgrad (das Produkt der tatsächlichen FRET – Effizienz und Fraktion von FRETing Donor / Akzeptor – Moleküle) können zusammen mit dem relativen Anteil der Donor- und Akzeptormolekülen 24 erhalten werden. Spectral ratiometrisch FRET wird oft mit unimolekularen FRET Biosensoren verwendet, wobei der Donor / Akzeptor-Stöchiometrie angenommen werden kann, bekannt sein. Um die Bevölkerungs Fraktionen des FRETing Donor- und Akzeptor bestimmen, beispielsweise eine Dosis – Wirkungskurve die Kenntnis der tatsächlichen FRET – Effizienz zu erhalten , ist erforderlich. Dies kann durch Messung einer positiven FRET Kontrollprobe mit bekannten Eigenschaften oder unter Verwendung einer anderen Methode zur Messung der FRET-Effizienz, wie Acceptor Photobleaching oder FLIM erhalten werden.
Mit Hilfe der Fluoreszenzlebensdauer Ablesungen können FRET erfasst und allein durch Messungen der Donoremission quantifiziert werden – die Notwendigkeit zur spektralen Kalibrierung und weitere Kontrollproben zu entfernen. Somit kann FLIM FRET Ablesungen zwischen den Instrumenten verglichen werdenund zwischen unterschiedlichen Proben – wodurch Daten aus Endoskopie oder Tomographie von lebenden Krankheitsmodellen 25 werden gegen gebenchmarkt Messungen der zellbasierte Assays. Durch den Einbau von Spender Fluoreszenzabklingkurve Profile auf einen geeigneten Multi-exponentiellen Abfall Modell FRETing entspricht, und nicht FRETing Spenderpopulationen, FRET-Effizienzen und Bevölkerungs Fraktionen können im Prinzip ohne weitere Messungen direkt erhalten werden. Diese signifikanten Vorteile kommen jedoch auf Kosten der FLIM erfordern mehr detektierten Photonen pro Pixel als spektral aufgelöste Intensität Bildgebung – in der Regel Hunderte von Photonen sind erforderlich, um eine Genauigkeit bei der Lebensdauerbestimmung von 10% bei der Montage zu einem einzigen exponentiellen Abfall-Modell zu erreichen, und wenn Fitting Fluoreszenzabklingzeit Profile Komplex (multiexponentiellen Zerfall) Modellen, die Anzahl der detektierten Photonen erhöht, um tausende erforderlich. Dies hat konventionell führte zu langen Erfassungszeiten (zehn bis einigen hundert Sekunden pro Feld von view) für FLIM, vor allem, wenn die Zeit mit korrelierten Einzelphotonenzählung (TCSPC) implementiert mit sequentiellen Pixelerfassung in der Laser-Scanning-Mikroskope. Versuche, die Bildgebungsgeschwindigkeit zu erhöhen, indem sie höhere Anregungsintensitäten mit erheblichen Photobleichens und / oder Phototoxizität führen kann. Zusammen mit einem Mangel an geeigneten im Handel erhältlichen Geräte und Software-Tools, hat diese FLIM von gehinderten für die Wirkstoffforschung oder Systembiologie in HCA genutzt werden, wo Hunderte bis Tausende von Sichtfeldern sind abgebildet werden. Laserscanning TCSPC FLIM wurde in einem automatisierten Multi – Well – Platte Mikroskop 26 für sekundäre Messungen nach der Identifikation von "Hits" von Steady-State – polarisationsaufgelöste Fluoreszenz Anisotropie Imaging 27 implementiert , die 28 ähnlich Belichtungsgeschwindigkeiten zu spektralen ratiometrisches Imaging erreichen kann , mit dem er teilt viele Vorteile und Nachteile. Fluoreszenzanisotropiemessungen Bildgebung nutzt die Abnahmein Fluoreszenzanisotropie des Akzeptors in Gegenwart von FRET und ist auch empfindlich gegenüber spektralen Übersprechens (zB direkte Anregung des Akzeptors). Es erfordert Kalibrierung für Polarisationsübersprechen zu berücksichtigen und stellt keine direkte Messung der FRET-Effizienz.
Um die Vorteile von FLIM für HCA zu realisieren, haben wir gearbeitet, um die Fragen der Geschwindigkeit der Bildaufnahme und einen breiteren Zugang zu der Technologie zu adressieren. Hier bieten wir eine komplette Liste der Open-Source-Software und Hardware-Komponenten, die verwendet werden können, die automatisierte schnelle FLIM Multi-Well-Platten-Lesegerät zu implementieren, die weiter unten beschrieben wird, zusammen mit Exemplar FRET basierten-Assays. In unserem Ansatz 29 wird FLIM realisiert mit Weitfeldzeit Gated Imaging eine gated optische Bildverstärker (GOI) mit, die in Abbildung 1 dargestellt ist , die schnellere Bildgebung Raten und geringere Photobleichens als Single-Beam Scanning TCSPC aufgrund der zur Verfügung stellen kann parallele Pixel interrogation. Unsere openFLIM-HCA Instrument kann unbeaufsichtigt FLIM liefern, erfordert nur wenige Sekunden FLIM Datenerfassungs einigen 100 Photonen pro Pixel ( in Abhängigkeit von der Helligkeit der Probe) zu erhalten. In Kombination mit der Zeit benötigt , um die Probe aus dem vorherigen Sichtfeld zu bewegen, die Anschaffungs Einstellungen anzupassen und die Probe im Fokus zu halten, dies führt in der Regel in Multi – Well – Platte Erfassungszeiten von ~ 10 s pro Sichtfeld 25,28. Optische Schnitte können mit einem quasi-Weitfeld Nipkow ( "Spinning Disc") Scanner 30 implementiert werden.
Für FLIM Datenanalyse haben wir eine Open – Source – Software – Tool namens FLIMfit 31 entwickelt, das schnell Multiwellplatte FLIM Datensätze auf herkömmlichen PC – Arbeitsplätzen zu analysieren und ist ein Plug-in für OMERO 32. FLIMfit bietet globale Analysefunktionen (besprochen in Abschnitt 1.2) , die FLIM Daten ermöglichen, komplexe Modelle mit o eingebaut werdenNLY einigen 100 Photonen pro Pixel unter der Annahme, dass die Fluoreszenzlebensdauer Komponenten über ein Bild invariant sind oder eine Region von Interesse (ROI), damit die Anzahl der detektierten Photonen erforderlich, die Belichtung der Probe und Bildaufnahmezeit zu verringern. Laufen FLIMfit auf einem Standard – Desktop – PC, benötigt nur 10s Sekunden Rechenzeit auf Datensätze analysieren Hunderte von FOVs umfasst. Damit beide FLIM Datenerfassung und Analyse kann auf Zeitskalen unternommen werden, die für die HCA praktisch sind.
openFLIM-HCA – Hardware
Unsere Implementierung von FLIM HCA besteht aus sechs Hauptkomponenten: (i) ein Fluoreszenzmikroskop Rahmen mit optischen Autofokus; (Ii) ein motorisiertes (xyz) Mikroskoptisch; (Iii) eine Anregungslaserquelle; (Iv) ein Weitfeldzeit gated FLIM System mit gated optischen Verstärker (GOI), Verzögerungsgenerator und der Kamera; (V) einen Computer zur Datenerfassung und Analyse und (vi) einer Nipkow-Scheibe scannerEinheit für die optische Bildgebung im Schnitt aus der Fokus Licht zu unterdrücken. Dies kann wichtig sein , wenn schwache Signale Bildgebung, beispielsweise von FRET Biosensoren an der Zellplasmamembran, die durch die Beiträge der zytoplasmatischen Fluoreszenz oder Hintergrund von Deckgläsern oder Kulturmedium überschwemmt werden könnte. Time-gated FLIM Daten werden durch Beleuchten der Probe mit dem ultrakurzen gepulsten Anregungsstrahlung, Abbilden der Fluoreszenzemission an die Photokathode des GOI und Erfassen einer Reihe von CCD-Bilder der Leuchtstoff der GOI für eine Reihe von Einstellungen der Zeitverzögerung erworben von die optische Verstärkergate nach der Ankunft der Anregungsimpulse. Da die Zeitgatterverzögerung nach Anregung erhöht wird, wird das Fluoreszenzsignal zu verringern, und die Reihe von zeitabhängigen Intensitätsfluoreszenzbilder auf dem CCD bilden die Datensatzes erforderlich ist, um zu analysieren, die Zerfallsprofile aller Fluorophore in dem Sichtfeld gewonnen gesehen . Die Verknüpfung von der indischen Regierung wird an die Anregungspulse synchronisiertund für die Reihe von CCD Nahmen, die Verzögerung des Zeittores relativ zu den Anregungspulsen eingestellt, um eine Reihe von Werten über den gewünschten Bereich zu erhöhen. Diese Synchronisation wird erreicht, den Verzögerungsgenerator verwenden, die eine "schnelle Verzögerung Box" (Bereitstellung von Verzögerungen bis zu 20 ns in 1 ps Stufen) umfasst und eine "grobe Verzögerungs Box", die Verzögerungen, die mit einem minimalen Schritt von 25 ps liefert.
Für FLIM kann die Anregung durch jede ultraschnellen Laser bereitgestellt werden. Der Einfachheit halber verwenden wir typischerweise einen Faserlasergepumpten Superquelle, die Pikosekundenpulsen abstimmbaren über das sichtbare Spektrum liefert, aus der die geeignete Anregungsstrahlung für jeden Fluorophor ausgewählt werden kann ein motorisiertes Filterrad mit unterschiedlichen Bandpassfilter verwenden. Typischerweise verwenden wir eine mittlere Leistung von ~ 100-200 & mgr; W bei der Probe mit Impulsen bei 40 oder 60 MHz Repetitionsrate. Solche Anregungsleistungen auch durch ultraschnelle Laserquellen auf Basis von Frequenzverdoppelung vorgesehen werden könnte vonmodengekoppelter Titan dotierten Saphir-Laser. Man beachte, daß eine Anregungsimpulsdauer unterhalb ~ 100 ps für die meisten Experimente ausreichend ist. Ein zweiter motorisierten Filterrad mit Neutraldichtefiltern ausgestattet wird die Anregungsintensität zu regulieren. Für die Sicherheit und Bequemlichkeit kann die Anregungsstrahlung über eine optische Einmodenfaser geliefert werden. Die Konfigurationen für die Weitfeld FLIM und optisch unterteilten FLIM sind in den 2 bzw. 3 dargestellt. Für weitere Einzelheiten über die genauen Komponenten verwendet, besuchen Sie bitte die openFLIM-HCA Wiki 33. Eine Kopie der aktuellen Stückliste ist im Zusatzmaterial gegeben.
Für Weitfeld FLIM wird die Anregungsstrahlung das gesamte Sichtfeld möglichst gleichmäßig auszuleuchten erforderlich. Hierzu leiten wir den Anregungslaserstrahl auf eine holographische "top-hat" Diffusor, der bei 10-50 Hz zu Zeit-Mittelwert der Laser Speckle, mit der Ebene der dif gedrehtFixiereinheit der hinteren Brennebene der Objektivmikroskoplinse abgebildet wird. Das Fluoreszenzbild von dem Ausgangsanschluss des Mikroskops wird auf die Photokathode des GOI und dem Leuchtstoff der GOI (aktive Bereich diagonal 18 mm) übertragen auf den Sensor einer gekühlten wissenschaftlichen CCD (Chipgrße 10,2 mm x 8,3 mm) abgebildet wird, Kamera ein Paar von Kameralinsen bietet eine Vergrößerung von 0,7 verwendet wird. Das System wird von einem Standard-PC gesteuert, die auf die Instrumentierung Schnittstelle verwendet RS232-Protokolle. Zusätzlich wird ein Arduino Mikroprozessor zu steuern, um einen Verschluß in dem Anregungslichtpfad verwendet, die außer geschlossen wird, wenn die CCD-Kamera FLIM Daten erwirbt und das Signal von einer Photodiode zu erfassen, die verwendet wird, um die Durchschnittsleistung der spektral gefilterten Supercontinuum zu messen Anregungsquelle. Für optisch unterteilten FLIM wird das Anregungslaserstrahlung gekoppelt in eine Single-Mode-polarisationserhaltende optische Faser, die direkt mit der Nipkow-Scheibe Scannereinheit, wie s verbindethown in Abbildung 3. Das Ausgangsfluoreszenzbild von der Nipkow Scannereinheit wird auf die Photokathode des GOI weitergeleitet und der Rest des Systems ist die gleiche wie für die Weitfeld FLIM.
openFLIM-HCA – Software
Die Datenerfassungssoftware ist in μManager 34 geschrieben. Es bietet die volle HCA Datenerfassungsfunktionen Optionen, einschließlich der Sequenz zu ändern, in dem die Vertiefungen der Platte abgebildet werden, Zeitverläufe für jeden FOV, zu erwerben, um automatisch pflegen Fokus während der Messung und zur Steuerung der Anregungs- und Emissionsfilterräder und den dichroitischen Wechsler für die automatisierte Multicolor-Imaging. Es ist auch möglich , eine "Vorabtastung" acquisition der Fluoreszenzintensität , um zu laufen , um automatisch zu identifizieren und die Positionen von geeigneten FOVs für eine nachfolgende FLIM Erwerb nach Kriterien aufnehmen, beispielsweise auf Basis von Intensität. FLIM HCA-Daten können als eine Reihe gespeichert werdenvon TIFF – Dateien, als eine Reihe von OME-TIFF – Dateien (dh eine pro FOV) oder als einzelne OME-TIFF – Datei , die alle Daten aus einer Multiwell – Platte enthält. Weitere Informationen und eine detaillierte Beschreibung der μManager Software kann auf der openFLIM-HCA Wiki 33 gefunden werden.
Die Datenanalyse – Software, FLIMfit 31, eine Open – Source – MATLAB-basierten Client für die OMERO Bilddaten – Management – Plattform 32, ist in der Lage FLIM Daten von einem OMERO Server oder von Computer – Festplatte zu lesen, wie in Abbildung 4 dargestellt. Es wurde entwickelt, um Daten aus TCSPC oder Weitfeldzeit gated FLIM Instrumente und viele Fähigkeiten passen Daten von openFLIM-HCA einschließlich Montage an monoexpotentielles Zerfallsprofile und verdoppeln exponentiell und höhere Profile Komplexität Verfall, einschließlich der Modelle liefert zu analysieren, wie polarisationsaufgelöste Fluoreszenzabklingkurve Profile. Es kann auch wegen der festen und zeitlich veränderliche nehmen Hintergrundsignale und können UTIlize einer gemessenen raumzeitlichen Instrument Antwortfunktion (IRF) oder eine idealisierte IRF passen verwenden, um einen Betrag von der vollständigen experimentellen IRF-Messung bestimmt auf einer pixelweisen Basis zeitverschoben sein kann. Eine globale Zeitdifferenz (t 0) zwischen dem IRF und einer fluoreszierenden Probe kann aus einer Messung eines Fluoreszenzstandard bestimmt werden. Räumliche Variationen in Hintergrundsignale und IRF können ebenfalls berücksichtigt werden. FLIMfit der Lage ist , FLIM Daten auf einer pixelweisen Basis oder unter Verwendung von "global binning" oder "global fitting" zu erleichtern Einbau von FLIM Daten mit bescheidenen (Hunderte) Photonenzahlen bis hin zu komplexen Zerfallsmodellen passen.
Global binning bringt zu jedem Zeitpunkt innerhalb eines benutzerdefinierten ROI aus den Pixeln alle detektierten Photonen Aggregieren ausreichende Photonenzahlen zu liefern , um komplexe Zerfallsmodelle zu ermöglichen Montage. Der ROI kann das gesamte Sichtfeld (FOV), kann es manuell defined durch den Benutzer, oder es kann Werkzeugen Bildsegmentierung bestimmt werden. Der ROI kann auch in FLIMfit von anderen Bildsegmentierung Software importiert unter Verwendung von Masken definiert werden. Für FRET-Anwendungen ist es üblich, global Binning zu verwenden, um ein Doppel exponentiellen Zerfalls Modell passen die Fluoreszenzlebensdauer Komponenten entsprechend FRETing und nicht-FRETing Donorfluorophore zu bestimmen, die räumlich invariant zu sein über den ROI angenommen werden und dann auf einem nachzurüsten pixelweisen Basis mit diesen vales Lebensdauer Komponente festgelegt, um die FRETing Spenderpopulation Fraktion in jedem Pixel zu erhalten.
Global Armatur beinhaltet Beschlag gleichzeitig die Lebensdauer Komponenten und pixelweise FRETing Spenderpopulation Fraktionen für einen ganzen FOV- oder über ein FLIM Datensatz, der mehrere FOVs aufweisen könnte, beispielsweise von einer Multiwellplatte Experiment oder eine Zeitreihe von Fluoreszenzlebensdauer Bilder. Globale Armatur ist in der Lage, die räumliche variati zu nutzenauf der Bevölkerungs Fraktionen über das Bild , das in dem globalen binning Ansatz verloren stärkere Einschränkungen für die Lebensdauer der Komponenten Schätzung bereitzustellen – und damit zuverlässigere Ergebnisse – allerdings auf Kosten einer erheblich mehr Rechen 35. FLIMfit schnell FLIM Multi – Well – Platte Datensätze mit globalen Montage auf herkömmlichen PC – Arbeitsplätze mit, beispielsweise ein Multi – Well – Zeit-gated FLIM Datensatz, erworben mit fünf Zeitfenstern für jede von 394 FOV jeweils bestehend aus 672 x 512 Pixeln und erfordert nur 32 Sekunden analysieren und 2 GB Speicher zu einem doppelten exponentiellen Abfall Modell 31 zu passen. Dies wurde durch Verwendung eines trennbaren nichtlinearen Least – Square – Anpassungsalgorithmus implementiert multithreaded parallel Algorithmen zu ermöglichen effektiven Skalierung auf Mehrkernprozessoren und die FLIMfit Code optimiert wurde Speicherverbrauch zu minimieren , erreicht. Figur 5 zeigt eine Momentaufnahme der grafischen Benutzerschnittstelle von FLIMfitund weitere Details finden Sie auf der Webseite in Bezug 36. Weitere Informationen über die globale Anpassung und globale Binning gegeben gefunden werden kann in Bezug 31 zu finden.
Das folgende Protokoll für FLIM HCA unsere openFLIM-HCA Instrumentierung und Software kann für eine breite Palette von Cell Imaging Experimente mit FLIM Ablesungen angepasst werden. Im allgemeinen FRET-Multiwellplatte Experimente entworfen werden sollte umfassen replicate Vertiefungen positive und negative biologische Kontrollen zusätzlich zu den Bedingungen untersucht. Hier wir die spezifische Implementierung beschreiben optisch unterteilten FLIM durchzuführen (siehe Figur 3) von Cos – Zellen, die FRET – Konstrukte bestehend aus dem mTurquoise fluoreszierendes Protein und fluoreszierende Protein Venus durch einen kurzen Peptid – Linker verbunden sind . Hier ist die mTq32V, mTq17V und mTq5V FRET-Konstrukte (in Repräsentative Ergebnisse Abschnitt) bieten niedrige, mittlere und hohe FRET Effizienzen zusammen mit dem nicht FRETing mTq5A konstruieren.Diese Konstrukte und die anderen Materialien benötigt, um dieses Protokoll zu folgen, werden in der Materialliste aufgeführt.
Wir haben ein automatisiertes Multiwellplatte Mikroskop für HCA mit zeitgesteuerten FLIM entworfen beschrieben. Dieses Instrument ist Open – Source – Software mit der Option in μManager geschrieben gesteuert unter Verwendung der Daten zu einem OMERO Server zu speichern und die Analyse FLIM Daten unternommen 36 FLIMfit Verwendung ist, ein Open – Source – Programm geschrieben in Matlab und erhältlich als OMERO Client 32 μManager Instrument Steuerungssoftware, openFLIM-HCA, ist eine Online – 33 mit einer Liste der Systemkomponenten 48 verfügbaren akademischen Forschern zu ermöglichen , ihre eigenen FLIM HCA Instrumente zu bauen.
Um robuste FLIM Daten zu erfassen, ist es notwendig , die indische Regierung und CCD Erwerb Einstellungen zu optimieren und 0 Berücksichtigung etwaiger Änderungen in t zu nehmen. Wie in 3.8.2 beschrieben, sollte die indische Regierung Verstärkungseinstellung und CCD-Kamera Integrationszeit ~ 75% des CCD-Dynamikbereich zu erreichen eingestellt werden. Usingen höhere GOI Spannungen und mehrere CCD – Rahmen Akkumulationen in jedem Zeitgatterverzögerung erhöht das Signal – Rausch – Verhältnis 49 jedoch erhöht dies die Gesamt FLIM Erfassungszeit (da weniger Fluoreszenzphotonen pro Rahmen vor der CCD – Kamera sättigt erfasst werden und so die Anzahl der Rahmen Akkumulationen erhöht werden) und so diese Trade-off für jedes Experiment werden sollte, entschieden sollte. Die Kalibrierung des Verzögerungsgenerators hängt von der Laserwiederholungsrate, und es ist daher notwendig, dass die richtige Kalibrierungsdatei für die Wiederholungsrate, um sicherzustellen, verwendet wird, in die Akquisitionssoftware geladen. Das Verfahren zur Kalibrierung der Verzögerung Box kann auf der openFLIM-HCA Wiki 33 gefunden werden.
Wenn das zellulare Autofluoreszenz auf das Fluoreszenzsignal gering im Vergleich ist, verwenden wir das Signal von einem gut enthält nur Kulturmedium mit der zeitveränderlichen Hintergrund (TVB) bereitzustellen. In den Hintergrundfluoreszenz aus dem Zellkulturmedium zu minimieren, vermeidenMedien Phenolrot enthält. Wenn das zellulare Autofluoreszenz signifikant ist, dann kann der TVB aus Messungen der unmarkierten Zellen abgeleitet werden. Allerdings muss in diesem Fall darauf geachtet werden, wie dies setzt voraus, daß der Hintergrund-Autofluoreszenz der gleiche für jedes Pixel in dem Bild ist. Diese Annahme wird ungültig, wenn der Autofluoreszenz signifikant in einer Zelle oder wenn der Anregungsstrahl oder Erfassungsempfindlichkeit variiert nicht gleichmäßig über das Sichtfeld.
Der Erwerb eines IRF Bildimpulsen gestreute Anregungslicht liefert die zeitliche IRF-Profil, das mit dem Datenmodell in den Anpassungsprozess und bietet auch eine Karte der räumlichen Variation des IRF über das Sichtfeld convolved wird. Das IRF kann durch Abbilden einer Streuprobe, wie eine kolloidale Suspension, obwohl in unserem Instrument gemessen werden, unter Verwendung von Anregungslicht gestreut von der Nipkow-Scheibe eine sauberere Messung des IRF bietet. Eine genaue Bestimmung des Zeitpunkts of die IRF ist wichtig, weil Fehler in der Zeitverzögerung zwischen der Anregung und zeit Gating signifikant die Anpassungsprozess auswirken können, insbesondere bei der Montage zu komplexen exponentiellen Zerfallsmodellen. Das IRF erworben gestreutem Erregungslicht nicht genau das, was für den Anpassungsprozess benötigt wird, weil es bei der Anregungswellenlänge aufgezeichnet wird, und nicht auf der Fluoreszenzemissionswellenlänge, die ihre Zeitsteuerung beeinflussen können, auch wenn die räumliche Variation des IRF gleich sein sollten bei beiden Wellenlängen. Zusätzlich kann die Streu IRF global kann in der Zeit relativ zu dem wahren IRF aufgrund einer unterschiedlichen optischen Weglänge von dem Streuobjekt verschoben, wie es der Fall für eine IRF ist von der Platte Nipkow erworben in optisch unterteilten FLIM. Diese Korrektur, t 0, was die erforderliche globale zeitliche Verschiebung ist, die auf die erworbenen gestreuten Anregungslicht IRF angewendet werden soll, wird aus den monoexpotentielles Referenzfarbstoff Daten berechnet , wie in Protocol Schritt 4.4. Die folgenden Farbstoffe können für verschiedene Anregungswellenlängen verwendet werden: eine 75 & mgr; M Cumarin 153 – Lösung in Methanol (τ ~ 4,3 ns 50) kann im Bereich von 295 bis 442 nm für die Anregung verwendet werden; eine 75 & mgr; M Cumarin 6 -Lösung in Ethanol (τ ~ 2,43 ns 37) kann im Bereich von 430-500 nm für die Anregung verwendet werden; und einer 75 & mgr; M Rhodamin B – Lösung in Wasser (τ ~ 1,7 ns 37) für eine Anregung im Bereich von 488 bis 575 nm verwendet werden. Wir bemerken , dass, obwohl es in FLIMfit möglich ist, in der Regel eine andere IRF für jedes Pixel des Systems zu verwenden , ist es sinnvoll, die Annahme zu machen , daß das räumlich variierende IRF den gleichen zeitlichen Verlauf für jedes Pixel in dem Bild hat stellt aber eine Reihe unterschiedlicher räumlich zeitlichen Verschiebungen relativ zum globalen t 0. Wir bezeichnen dies als die IRF Schaltkarte, die aus dem Streulicht IRF bestimmt wird. Zusammen sind das IRF – Profil, t 0 und die IRF Verschiebung Karte en verwendetsicher, dass jedes Pixel in dem FOV mit einem geeigneten IRF angebracht ist. Wichtig ist, dass t 0 langsam im Laufe der Zeit variieren , so dass es vor jedem FLIM Datenerfassung gemessen werden soll.
Der Benutzer sollte entscheiden, wie die Fluoreszenzabklingkurve Profile zur Probe und wird benötigt, um die Breite der Zeitfenster und ihre relativen Verzögerungen nach der Anregung zu setzen. Im allgemeinen ist es wünschenswert, breite Gatebreiten verwenden, um das detektierte Signal zu maximieren und typischerweise verwenden wir Gate-Breiten auf 4 ns für FLIM von mit Fluoreszenzproteine markierten Zellen. Die Anzahl der Zeit-Gate-Verzögerungen sollte ausreichen, um das fluoreszierende Abklingprofil Probe (einschließlich ein Tor gesetzt, das Signal unmittelbar vor dem Anregungsimpuls zu messen) die Komplexität der Anpassungsmodell gegeben, die in der Analyse verwendet werden. Der optimale Wert kann auf die Lebensdauer und die relativen Amplituden der Zerfallskomponenten abhängen. In der Regel 4 Tore für die Montage monoexpotentielles ausreichend sind, zerfällt während 7 oder mehr Tore könnenwerden für komplexere Zerfallsmodelle verwendet.
Wir stellen fest , dass FLIM mit einer Reihe von durchgeführt werden kann im Zeitbereich oder Frequenzbereich Techniken und automatisierte FLIM HCA von Multi – Well – Platte – Arrays wurde zum ersten Mal in einem (nicht Schnitte) Weitfeldmikroskop Frequenzbereich Lebensdauer Ablesungen von FRET 51 umgesetzt. Die erste automatische optische Schnitte FLIM Multi – Well – Plattenleser für HCA Weitfeldzeit Gated Imaging – 28 verwendet wurde dann berichtet. Anschließend Weitfeld (nicht Sektionieren) Frequenzbereich FLIM HCA angewendet wurde für posttranslationale Modifikationen (Tyrosin – Phosphorylierung) in einer Genbank zu screenen FRET unter Verwendung von 52 und mit Zeitfenster FLIM HCA wurde angewendet , um FRET – Assays von HIV-1 Gag 53 Oligomerisierung und von SUMO von FOXM1 54 und von Raichu RhoA und Rac1 Biosensoren 33. Es ist auch möglich TCSPC für Multi – Well – Platte FLIM 26 aber bisher zu verwenden , hat es sich als herausfordernd t entsprechener Durchsatz von Techniken Weitfelderkennung nutzen. Ein Schwellen Ansatz, dieses Problem zu beheben könnte , ist die Verwendung von Arrays von Einzelphotonenzählung Detektoren wie SPAD – Arrays 55.
Wir nehmen zur Kenntnis , dass alle Ablesungen von FRET Fluoreszenzproteine verwenden , sollten aus FLIMfit oder einer anderen FLIM – Analyse – Software erhalten , mit Vorsicht und dass die absoluten Werte der Parameter behandelt werden , wird sich auf die mit dem passenden Modell zugeordnet Annahmen abhängen. Zum Beispiel, in dem der FRET-Donor eine signifikante zweite Zerfallskomponente hat, die Verwendung eines biexponentiellen Modell die FRET FLIM Daten passen in den Beitrag der schnelleren Zerfall Komponente zur Folge haben, in der Regel mit der FRETing Bevölkerung erscheinen, verbunden sind höher als es sollte. Es ist daher wünschenswert Donatoren mit einer monoexponentiellen Lebensdauer wie mTq2FP zu verwenden. Schon damals haben neuere Studien gezeigt, dass FRET-Analyse noch durch dunkle Zustände der Akzeptor-Fluoreszenzproteine beeinflusst werden kann oder durchHeterogenität der Orientierungsfaktor κ 2 aufgrund einer Verteilung von Fluorophor Konformationen mit einer Vielzahl von Chromophor Winkel und Abstände 56. Dennoch haben wir und andere gezeigt, dass die Fluoreszenzlebensdauer Ablesungen von FRET brauchbare Ergebnisse produzieren zu tun, die mit biochemischen Messungen korrelieren und kann verwendet werden für Protein-Interaktionen zu screenen oder Dynamik von Biosensoren zu folgen. Somit ist dieses openFLIM HCA Plattform kann auf eine Vielzahl von Fluoreszenzlebensdauer basierende Tests angewendet werden FRET oder zelluläre Autofluoreszenz unter Verwendung von 8, sowie die Bereitstellung quantitative Ablesungen von farbstoffbasierten Sonden 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |