Vi presentiamo un alto contenuto strumento open source di analisi (HCA) che utilizza l'imaging di fluorescenza vita automatizzato (FLIM) per saggiare le interazioni delle proteine che utilizzano Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) letture basate. L'acquisizione dei dati per questo strumento openFLIM-HCA è controllato da un software scritto in μManager e l'analisi dei dati viene effettuata in FLIMfit.
We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.
L'uso crescente di analisi del contenuto ad alta automatizzata (HCA) nella scoperta della droga da 1 a librerie di composti di analisi è completata dalla tendenza in scienze della vita ricerca di base verso esperimenti di imaging automatizzati per studi sistematici, ad esempio, per gli schermi fenotipiche delle biblioteche siRNA. HCA automatica sta diventando sempre più importante per gli studi più piccoli della scala biologica che sono state attuate in genere con gli esperimenti manuali con decine di piatti di cellule imaged con microscopi convenzionali. La potenza statistica conferito dalla capacità di saggiare e analizzare centinaia di migliaia di campi di vista consente media del rumore sperimentale (tra cui "rumore biologico") e l'automazione di acquisizione e l'analisi di grandi array di esempio i dati delle immagini può aiutare a eliminare pregiudizi operatore e spesso può essere utilizzato per rilevare il verificarsi di errori sistematici, come un cambiamento nel profilo IRF durante un'acquisizione. saggi di fluorescenza a basesono ampiamente implementati in HCA, con il più commercialmente disponibili HCA strumentazione di acquisire immagini intensità di fluorescenza in uno o più canali spettrali per mappare la relativa distribuzione e co-localizzazione delle proteine marcate. Più sofisticate modalità di imaging di fluorescenza, come l'imaging di fluorescenza vita (FLIM), l'imaging anisotropia polarizzazione e imaging di fluorescenza anisotropia tempo risolto, non sono ampiamente sfruttati in strumenti HCA commerciali, anche se essi offrono potenti letture quantitativi, ad esempio, di interazioni proteina. Qui vi presentiamo un approccio open source per implementare FLIM in un microscopio automatico per HCA.
Fluorescenza durata fornisce una lettura spettroscopico intrinsecamente raziometrico che può essere utilizzata per distinguere specie molecolari differenti o per sondare l'ambiente molecolare locale di un fluoroforo ed è insensibile alla concentrazione fluoroforo, alle efficienze di eccitazione / rilevazione, e all'impatto della scatteanello e il campione assorbimento 2. Inoltre, poiché le misurazioni di fluorescenza durata possono essere realizzati in un unico canale spettrale, sono direttamente confrontabili tra i vari strumenti e campioni senza calibrazione. Essi possono essere applicati a fluorofori endogeni, tra cui alcuni metaboliti cellulari, lipidi e componenti della matrice extracellulare, per fornire letture intrinseche dei processi biologici e patologie. Così FLIM senza etichetta può mappare i cambiamenti metabolici nelle cellule 3,4 ed è stato applicato per monitorare la differenziazione delle cellule staminali 5,6 e la crescita di ponteggi di collagene 7. Abbiamo recentemente dimostrato che FLIM HCA può essere utilizzato per i test senza etichetta automatizzati di metabolismo cellulare utilizzando autofluorescenza 8. Più comunemente, tuttavia, le misurazioni di fluorescenza durata e FLIM sono applicati ai fluorofori esogeni che etichetta biomolecole specifiche, spesso implementate utilizzando coloranti che macchiano compartimenti cellulari, utilizzando coloranti accoppiato antibodies che bersaglio specifiche proteine in cellule fisse, o utilizzando fluorofori geneticamente espresse accoppiati a proteine specifiche. vita fluorescenza può essere utilizzato per fornire solide letture quantitativi di sonde fluorescenti rilevamento del loro ambiente fisico o chimico. Per esempi, coloranti sono stati dispiegati per rilevare la fase lipidica locale delle membrane cellulari 9 o viscosità cella 10 e biosensori a base di proteine fluorescenti geneticamente espressi sono stati sviluppati per segnalare concentrazioni di cellule di segnalazione molecole anche per quanto IP3 11, PIP2 12 e calpaina 13 o ioni come calcio 14,15, potassio e cloruro 16 17.
Molti di questi biosensori utilizzano trasferimento di energia per risonanza (FRET) 18,19 per fornire letture dei cambiamenti nella conformazione biosensore. FRET tra il "donatore" e fluorofori "accettore" avviene tramite una interazione dipolo-dipolo diretta a corto raggioper cui fluorofori sono tipicamente separati da meno di ~ 10 nm. Così il rilevamento di FRET indica la vicinanza delle proteine opportunamente etichettati e quindi fornisce un mezzo per leggere le interazioni proteina-proteina 20, come vincolante o oligomerizzazione – sia come punti finali in cellule fisse o eventi dinamici nelle misurazioni corso del tempo di vivere cellule. Etichettando un costrutto molecolare appropriata con donatore e accettore fluorofori, è anche possibile leggere variazioni conformazionali – o scissione – del costrutto tramite la variazione di FRET e questa è la base di molti biosensori 21. Le misure di efficienza FRET in grado di fornire informazioni sulla distanza del donatore-accettore e la frazione popolazione di fluorofori donatori sottoposti FRET. Così, tecniche di imaging FRET-based può essere utilizzato per mappare e quantificare le interazioni molecolari nello spazio e nel tempo, ad esempio, per chiarire la segnalazione delle cellule elabora 22. Automating queste tecniche di imaging in grado di fornire analisi high throughput in base a letture di vie di segnalazione o reti.
In HCA, la lettura FRET più comunemente adottata è spettrale di imaging raziometrico, dove sono mappati variazioni del rapporto di accettore all'intensità donatore. Mentre questo approccio è facilmente implementata – ed è disponibile in molti lettori di piastre multipozzetto disponibili commercialmente – misurazioni quantitative FRET spettralmente risolte richiedono la calibrazione della risposta spettrale del sistema 23. Questo include spettrale diafonia derivante dalla spettrale spurgo attraverso e l'eccitazione diretta del accettore nonché le caratteristiche di trasmissione dello strumento e il campione (effetto filtro interno). In linea di principio, questo comporta la misurazione di ulteriori campioni di "controllo" che sono etichettati sia con donatore solo o accettore-only.
Da tali misurazioni FRET raziometrico spettrali, un FRET efficaceefficienza (il prodotto della efficienza FRET effettiva e frazione di FRETing molecole donatore / accettore) può essere ottenuta, insieme alla proporzione relativa di donatore e accettore molecole 24. Spettrale FRET raziometrico è spesso usato con biosensori unimolecolare tasto, dove la stechiometria donatore / accettore può supporre di essere conosciuto. Per determinare le frazioni di popolazione del donatore FRETing e accettore, ad esempio, per ottenere una curva di risposta alla dose, è necessario conoscere l'effettiva efficacia FRET. Questo può essere ottenuto misurando un campione di controllo positivo FRET con proprietà note o utilizzando un altro metodo per misurare l'efficienza FRET, come photobleaching accettore o FLIM.
Utilizzando letture di fluorescenza a vita, FRET può essere rilevato e quantificato le misure di emissione del donatore solo – eliminando la necessità di calibrazione spettrale e altri campioni di controllo. Così, letture FLIM FRET possono essere confrontati tra gli strumentie tra i diversi campioni – che consentono i dati da endoscopia o la tomografia di modelli di malattia in tempo reale 25 per essere confrontata misure di saggi cellulari. Montando i profili di decadimento dei donatori di fluorescenza a un modello di decadimento multi-esponenziale appropriata corrispondente alla FRETing e le popolazioni di donatori non FRETing, FRET efficienza e frazioni popolazione può, in linea di principio, essere ottenute direttamente senza ulteriori misurazioni. Questi vantaggi significativi, tuttavia, porta a costo di FLIM da fotoni più identificati per pixel di immagini intensità spettralmente risolta – tipicamente centinaia di fotoni sono necessari per ottenere una precisione nella determinazione vita del 10% quando montato su un unico modello di decadimento esponenziale e quando raccordo profili di fluorescenza di decadimento a modelli complessi (multiesponenziali decadimento), il numero di fotoni rilevati aumenta a migliaia necessari. Questo è convenzionalmente portato a lunghi tempi di acquisizione (decine a centinaia di secondi per campo di view) per FLIM, in particolare quando si utilizza il tempo correlato conteggio di singolo fotone (TCSPC) realizzato con l'acquisizione di pixel sequenziale in microscopi a scansione laser. I tentativi di aumentare la velocità di esposizione utilizzando intensità di eccitazione più alti può portare a photobleaching significativi e / o fototossicità. Insieme ad una mancanza di adeguati strumenti di strumentazione e software disponibili in commercio, questo ha impedito FLIM da essere utilizzato in HCA per la scoperta o sistemi di droga biologia, dove centinaia di migliaia di campi di vista sono da acquisire. La scansione laser TCSPC FLIM è stato implementato in un microscopio piastra di pozzetti automatizzato 26 per le misure secondarie in seguito all'identificazione di "hits" di stato stazionario polarizzazione risolto imaging di fluorescenza anisotropia 27, che può raggiungere velocità di imaging simili a spettrali immagini raziometrico 28 con il quale condivide molti vantaggi e svantaggi. imaging di fluorescenza anisotropia sfrutta la diminuzionein anisotropia di fluorescenza del accettore in presenza di FRET ed è anche sensibile alla spettrale cross-talk (ad esempio, l'eccitazione diretta della accettore). Richiede calibrazione per tenere conto di polarizzazione diafonia e non fornisce una misura diretta della efficienza FRET.
Per realizzare i vantaggi dei FLIM per HCA, abbiamo lavorato per risolvere i problemi di velocità di acquisizione delle immagini e un accesso più ampio alla tecnologia. Qui, forniamo un elenco completo dei componenti software e hardware sorgente aperti che possono essere utilizzati per implementare il lettore che è descritto qui di seguito, insieme a base-test esemplare FRET automatizzato rapido FLIM pozzetti piatto. Nel nostro approccio 29, FLIM è realizzato utilizzando grande campo dell'imaging tempo-dipendenti utilizzando una gated immagine ottica intensificatore (GOI), che è illustrata in figura 1 che può fornire tassi di imaging più veloci e inferiore fotoscolorimento rispetto a singolo fascio di scansione TCSPC causa della interr pixel paralleleogation. Il nostro strumento openFLIM-HCA può fornire FLIM senza supervisione, che richiede solo pochi secondi per acquisire dati FLIM rilevamento pochi 100 fotoni per pixel (a seconda della luminosità del campione). Combinato con il tempo necessario per spostare il campione dal campo precedente di vista, per regolare le impostazioni di acquisizione e di mantenere il campione a fuoco, questo provoca tipicamente tempi di acquisizione piastra multipozzetto di ~ 10 s per campo visivo 25,28. Sezionamento ottico può essere implementato usando un quasi-largo campo Nipkow ( "disco rotante") dello scanner 30.
Per l'analisi dei dati FLIM, abbiamo sviluppato uno strumento software open source chiamato FLIMfit 31 che è in grado di analizzare rapidamente pozzetti insiemi di dati piastra FLIM su postazioni PC convenzionali ed è un plug-in per OMERO 32. FLIMfit offre funzionalità di analisi a livello globale (riportate nella Sezione 1.2) che permettono i dati FLIM ad essere montati sui modelli complessi con oolo pochi 100 fotoni per pixel sotto l'ipotesi che i componenti di fluorescenza durata sono invarianti attraverso un'immagine o regione di interesse (ROI), riducendo così il numero di fotoni rilevati richiesto, l'esposizione alla luce per il tempo di campionamento e acquisizione dell'immagine. FLIMfit esecuzione su un PC desktop standard, richiede solo 10 secondi di secondi di tempo di calcolo per analizzare insiemi di dati che comprende centinaia di FOV. Così sia l'acquisizione dei dati e l'analisi FLIM possono essere intraprese in tempi che sono pratici per HCA.
hardware openFLIM-HCA
La nostra implementazione di FLIM HCA è composto da sei componenti chiave: (i) un telaio microscopio a fluorescenza con autofocus ottica; (Ii) un motorizzato (xyz) palco microscopio; (Iii) una sorgente laser di eccitazione; (Iv) un sistema FLIM tempo-dipendenti in tutto il campo con intensificatore gated ottica (GOI), generatore di ritardo e la macchina fotografica; (V) un computer per l'acquisizione e analisi dei dati e (vi) uno scanner disco NipkowUnità per l'imaging ottico sezionato per sopprimere dalla luce fuoco. Questo può essere importante quando l'imaging segnali deboli, per esempio, da biosensori FRET alla membrana plasmatica delle cellule, che potrebbero essere sommersi da contributi di fluorescenza citoplasmatica o di sfondo da coprioggetto o terreno di coltura. dati FLIM tempo-dipendenti è acquisita da illuminare il campione con il ultracorti impulsi di radiazione di eccitazione, l'imaging l'emissione di fluorescenza a fotocatodo del GOI e l'acquisizione di una serie di immagini CCD del fosforo del governo indiano per una serie di impostazioni di ritardo di cancello intensificatore ottica dopo l'arrivo degli impulsi di eccitazione. Poiché il ritardo di porta tempo dopo eccitazione viene aumentata, il segnale di fluorescenza è visto a diminuire e la serie di immagini di fluorescenza time-gated acquisite sul CCD formano il set di dati richiesta per analizzare i profili decadimento di tutti i fluorofori nel campo visivo . Il gating del GOI è sincronizzato con gli impulsi di eccitazionee, per la serie di acquisizioni CCD, il ritardo del cancello tempo relativo agli impulsi di eccitazione è impostata una serie di valori crescenti nel range desiderato. Questa sincronizzazione si ottiene utilizzando il generatore di ritardo che comprende una "scatola veloce ritardo" (che fornisce ritardi fino a 20 ns in passi di 1 PS) e una "scatola ritardo grossolano" che fornisce i ritardi con un passo minimo di 25 ps.
Per FLIM, l'eccitazione può essere fornita da un laser ultraveloce. Per comodità, si impiegano tipicamente una sorgente supercontinuo fibra-laser-pompato che fornisce impulsi di picosecondi sintonizzabile tutto lo spettro visibile da cui la radiazione di eccitazione appropriato può essere selezionato per ogni fluoroforo utilizzando una ruota portafiltri motorizzata con diversi filtri passa banda. Tipicamente, si usa una potenza media di ~ 100-200? W al campione con impulsi a frequenza di ripetizione 40 o 60 MHz. Tali poteri di eccitazione potrebbero anche essere forniti da sorgenti laser ultraveloci in base raddoppio della frequenza dimode-locked titanio drogato laser zaffiro. Si noti che una durata dell'impulso di eccitazione sotto ~ 100 ps è sufficiente per la maggior parte degli esperimenti. Una seconda ruota portafiltri motorizzata dotata di filtri a densità neutra viene utilizzata per regolare l'intensità di eccitazione. Per la sicurezza e la convenienza, la radiazione di eccitazione può essere consegnato tramite una fibra ottica monomodale. Le configurazioni per largo campo FLIM e FLIM otticamente sezionato sono rappresentati nelle figure 2 e 3, rispettivamente. Per maggiori dettagli dei componenti di precisione utilizzati, si prega di visitare il wiki openFLIM-HCA 33. Una copia dell'elenco delle parti corrente è dato nel materiale supplementare.
Per grande campo FLIM, la radiazione di eccitazione è necessaria per illuminare l'intero campo di vista più uniforme possibile. Per questo abbiamo diretto il fascio laser di eccitazione ad un diffusore olografico "top-hat" che è ruotato a 10-50 Hz al tempo medio speckle laser, con il piano del diffusore viene esposta al piano focale posteriore della lente del microscopio obiettivo. L'immagine di fluorescenza dalla porta di uscita del microscopio viene trasmessa sul fotocatodo del GOI e il fosforo del GOI (area attiva diagonale 18 mm) viene ripreso sul sensore di un CCD scientifica raffreddata (chip di dimensioni 10,2 millimetri x 8.3 mm) telecamera con un paio di lenti della fotocamera forniscono un ingrandimento di 0,7. Il sistema è controllato da un PC standard che è interfacciato alla strumentazione utilizzando protocolli RS232. Inoltre, un microprocessore Arduino è utilizzato per controllare un otturatore nel percorso ottico di eccitazione che viene chiuso tranne quando la telecamera CCD sta acquisendo dati FLIM e per registrare il segnale da un fotodiodo che viene utilizzato per misurare la potenza media dal supercontinuo spettralmente filtrato sorgente di eccitazione. Per FLIM otticamente sezionata, la radiazione laser di eccitazione è accoppiata in una fibra ottica monomodale a mantenimento di polarizzazione che collega direttamente l'unità scanner disco Nipkow, come shown in figura 3. L'immagine di output di fluorescenza dalla unità scanner Nipkow viene trasmessa sul fotocatodo del GOI e il resto del sistema è lo stesso che per tutto il campo FLIM.
software openFLIM-HCA
Il software di acquisizione dei dati è scritto in μManager 34. Fornisce funzionalità di acquisizione dati completa HCA compresa la possibilità di cambiare la sequenza in cui vengono esposte le pozzetti della piastra, di acquisire corsi a tempo per qualsiasi FOV, per mantenere automaticamente messa a fuoco durante le misurazioni e di controllare le ruote di eccitazione e di filtro delle emissioni e il cambia dicroico per l'imaging multicolore automatizzato. È anche possibile eseguire un'acquisizione "scansione preliminare" di intensità di fluorescenza per identificare automaticamente e registrare le posizioni del FOV adeguato successiva acquisizione FLIM a seconda, ad esempio, sulla base di intensità. dati HCA FLIM possono essere salvati come una seriedi file TIFF, come una serie di file OME-TIFF (ad esempio, uno per FOV) o come un singolo file OME-TIFF che incorpora tutti i dati da una piastra di pozzetti. Maggiori informazioni e una descrizione dettagliata del software μManager possono essere trovati sul openFLIM-HCA wiki 33.
Il software di analisi dei dati, FLIMfit 31, un client open source MATLAB-based per la piattaforma di gestione dei dati di immagine OMERO 32, è in grado di leggere i dati da un server FLIM OMERO o dal disco del computer, come indicato in figura 4. E 'stato progettato per analizzare i dati provenienti da TCSPC o strumenti FLIM tempo-dipendenti in tutto il campo e fornisce molte funzionalità per adattarsi dati da openFLIM-HCA compreso il montaggio di monoesponenziale profili di decadimento, e di raddoppiare i profili di decadimento complessità esponenziale e superiore, compresi modelli come profili di fluorescenza di decadimento polarizzazione risolto. Si può anche tener conto dei segnali di fondo fissi e variabili nel tempo e può utiLize una funzione misurato spazio-temporale risposta dello strumento (IRF) o può andare bene con un IRF idealizzato che può essere in differita su base pixel-saggio di un importo fissato dalla misura piena sperimentale IRF. A differenza di tempo globale (t 0) tra la IRF ed un campione fluorescente può essere determinata da una misura di uno standard di fluorescenza. variazioni spaziali a segnali di fondo e IRF possono anche essere presi in considerazione. FLIMfit è in grado di adattare i dati FLIM su una base pixel-saggio o l'utilizzo di "binning globale" o "raccordo globale" per facilitare il montaggio dei dati FLIM con modeste (centinaia) fotone numeri ai modelli di decadimento complessi.
Binning globale comporta aggregando tutti i fotoni rilevati dai pixel all'interno di un ROI definito dall'utente in ogni punto di tempo per fornire i numeri di fotoni sufficienti per consentire il montaggio di modelli di decadimento complessi. Il ROI può essere l'intero campo visivo (FOV), può essere manualmente defined dall'utente, oppure può essere determinato tramite gli strumenti di segmentazione. Il ROI può anche essere definita utilizzando maschere importati in FLIMfit da altri software di segmentazione delle immagini. Per le applicazioni FRET, è comune l'uso di binning globale per adattarsi a un modello di doppio esponenziale di decadimento per determinare i componenti di fluorescenza di durata corrispondente al FRETing e fluorofori donatori non FRETing che si presume essere spazialmente invarianti attraverso il ROI e poi a rimontare su un elaborando pixel saggio con queste valli componenti vita fisse per ottenere la frazione popolazione FRETing donatori in ciascun pixel.
Raccordo globale comporta contemporaneamente montaggio dei componenti a vita e frazioni di popolazione FRETing donatore pixel-saggio in un intero FOV- o attraverso un insieme di dati FLIM che potrebbe comprendere più FOV, per esempio, da un esperimento piatto pozzetti o una serie temporale di immagini di fluorescenza di vita. raccordo Global è in grado di sfruttare la Variati spazialesu di frazioni di popolazione in tutta l'immagine che si perde nell'approccio binning globale per fornire vincoli più forti sulla stima durata dei componenti – e risultati quindi più affidabili – anche se a costo di molto di più di calcolo 35. FLIMfit possono analizzare rapidamente pozzetti insiemi di dati piastra FLIM con attacco globale sulla workstation PC convenzionali con, per esempio, un set multipozzetto tempo-dipendenti dei dati FLIM, acquisiti con cinque porte di tempo per ciascuno dei 394 FOV ciascuno composto da 672 x 512 pixel, che richiede solo 32 secondi e 2 GB di memoria per adattarsi ad un doppio esponenziale modello di decadimento 31. Ciò è stato ottenuto utilizzando un non lineare separabile almeno algoritmo squadretta implementato utilizzando algoritmi paralleli multithread per consentire scalabilità efficace su processori multicore e al codice FLIMfit è stato ottimizzato per ridurre al minimo l'utilizzo della memoria. La Figura 5 mostra una fotografia della interfaccia utente grafica di FLIMfite maggiori dettagli possono essere trovati nella pagina web indicata in riferimento 36. Ulteriori informazioni sul raccordo globale e binning globale può essere trovato in riferimento 31.
Il seguente protocollo per HCA FLIM con la nostra strumentazione openFLIM-HCA e software può essere adattato per una vasta gamma di esperimenti di imaging cellulare con letture FLIM. In generale, piastra di pozzetti FRET esperimenti dovrebbero essere progettati per includere pozzi repliche di controlli biologici positivi e negativi, oltre alle condizioni in fase di studio. Qui, descriviamo l'implementazione specifica per eseguire FLIM otticamente in sezione (vedi figura 3) di cellule Cos esprimono FRET costruisce costituito dalla proteina fluorescente mTurquoise e proteina fluorescente Venere uniti da una breve linker peptide. Qui il mTq32V, mTq17V e mTq5V FRET costrutti (discusse nella sezione Risultati rappresentativi) fornire a basso, medio e alto efficienza FRET insieme con la non-FRETing mTq5A costrutto.Questi costrutti e gli altri materiali necessari per seguire questo protocollo sono elencati nella Lista dei materiali.
Abbiamo descritto un microscopio piastra di pozzetti automatizzato progettato per HCA usando FLIM tempo-dipendenti. Questo strumento è controllato tramite il software open source scritto in μManager con la possibilità di salvare i dati su un server OMERO e l'analisi dei dati FLIM essere effettuata utilizzando FLIMfit 36, un programma open source scritto in MATLAB e disponibile come client OMERO 32 Lo strumento μManager software di controllo, openFLIM-HCA, è disponibile on-line 33 con un elenco dei componenti del sistema 48 per consentire ai ricercatori accademici di costruire i propri strumenti FLIM HCA.
Al fine di acquisire i dati FLIM robuste, è necessario ottimizzare le impostazioni di acquisizione GOI e CCD e di tener conto di eventuali variazioni in t 0. Come descritto in 3.8.2, il guadagno e la fotocamera CCD tempo di integrazione governo indiano deve essere impostato per raggiungere ~ 75% della gamma dinamica del CCD. Ucantare più elevate tensioni GOI e più accumuli telaio CCD ad ogni ritardo cancello volta aumenta il rapporto segnale-rumore 49, ma questo aumenta il tempo di acquisizione FLIM totale (da un minor numero di fotoni di fluorescenza vengono acquisiti per fotogramma prima che i saturi telecamera CCD e quindi il numero di accumuli telaio dovrebbe essere aumentato) e quindi questo trade-off dovrebbe essere deciso per ogni esperimento. La taratura del generatore ritardo dipende dalla frequenza di ripetizione del laser ed è quindi necessario garantire che il file di calibrazione corretto per la frequenza di ripetizione utilizzato viene caricato nel software di acquisizione. La procedura per calibrare la casella di ritardo può essere trovato sul openFLIM-HCA wiki 33.
Se l'autofluorescenza cellulare è bassa rispetto al segnale di fluorescenza, si usa il segnale da un supporto di cultura giusta pozzetto contenente fornire lo sfondo tempo-variante (TVB). Per minimizzare fluorescenza di fondo dal mezzo di coltura cellulare, evitiamosupporti contenenti rosso fenolo. Se l'autofluorescenza cellulare è significativo, allora il TVB può essere derivato da misurazioni delle cellule non marcate. Tuttavia, in questo caso bisogna fare attenzione, come questo presuppone che lo sfondo autofluorescenza è la stessa per ogni pixel dell'immagine. Questo presupposto non sarà valida se l'autofluorescenza varia significativamente una cella o se il fascio di eccitazione o la sensibilità di rilevamento non è uniforme nel campo di vista.
L'acquisizione di un'immagine IRF utilizzando impulsi di luce di eccitazione sparsi fornisce il profilo IRF temporale che è convoluta con il modello di dati nel processo di montaggio e fornisce anche una mappa della variazione spaziale della IRF attraverso il campo di vista. L'IRF può essere misurata l'imaging di un campione di dispersione quale una sospensione colloidale anche se, nel nostro strumento, usando luce di eccitazione dispersa dal disco Nipkow fornisce una misurazione più pulita del IRF. determinazione accurata della tempistica of la IRF è importante perché gli errori nel tempo di ritardo tra l'eccitazione e il tempo-gating possono influire in modo significativo il processo di adattamento, in particolare quando il montaggio di modelli di decadimento esponenziale complessi. L'IRF ha acquisito utilizzando la luce di eccitazione diffusa non è esattamente ciò che è necessario per il processo di adattamento, perché è registrato alla lunghezza d'onda di eccitazione piuttosto che alla lunghezza d'onda di emissione di fluorescenza, che può influenzare la sua tempistica, anche se la variazione spaziale della IRF dovrebbe essere la stessa ad entrambe le lunghezze d'onda. Inoltre, l'IRF disperso può essere spostata a livello globale in tempo relativo alla vera IRF causa di un cammino ottico divergente dall'oggetto dispersione, come nel caso di un IRF acquisito dal disco Nipkow in FLIM otticamente sezionata. Tale correzione, t 0, che è lo spostamento temporale globale necessaria da applicare alla acquisito sparsi IRF luce di eccitazione, è calcolata dai dati colorante riferimento monoesponenziali come indicato in ProtoCpasso olo 4.4. I seguenti coloranti possono essere utilizzati per diverse lunghezze d'onda di eccitazione: a 75 pM cumarina 153 soluzione in metanolo (τ ~ 4,3 ns 50) può essere usata per l'eccitazione nell'intervallo 295-442 nm; un 75 mM cumarina 6 soluzione in etanolo (t ~ 2,43 ns 37) possono essere utilizzati per l'eccitazione nell'intervallo 430-500 nm; e 75 mM soluzione rodamina B in acqua (τ ~ 1,7 ns 37) può essere usata per l'eccitazione nell'intervallo 488-575 nm. Notiamo che, sebbene sia possibile in FLIMfit utilizzare un diverso IRF per ciascun pixel del sistema, di solito è ragionevole fare l'ipotesi che la spazialmente variabili IRF ha lo stesso profilo temporale per ogni pixel dell'immagine, ma presenta una gamma di spazialmente variabile offset temporali relativi alla t globale 0. Descriviamo questo come la variazione di mappa IRF, che è determinata dalla IRF luce diffusa. Insieme, il profilo IRF, t 0 e la mappa spostamento IRF vengono usati per enAssicurarsi che ogni pixel nel FOV è dotata di un IRF appropriata. È importante sottolineare che, t 0 può variare lentamente nel tempo e quindi dovrebbe essere misurato prima di ogni acquisizione dati FLIM.
L'utente deve decidere come per assaggiare i profili di decadimento di fluorescenza ed è necessario per impostare la larghezza dei termini cancelli ed i loro relativi ritardi dopo l'eccitazione. In generale, è auspicabile utilizzare ampie larghezze di gate per massimizzare il segnale rilevato e tipicamente usiamo larghezze di gate impostati a 4 ns per FLIM di cellule marcate con proteine fluorescenza. Il numero di ritardi di tempo-gate dovrebbe essere sufficiente per campionare il profilo di decadimento fluorescente (compresa una porta impostato per misurare il segnale appena prima dell'impulso di eccitazione) data la complessità del montaggio di modello che verrà utilizzato nell'analisi. Il valore ottimale può dipendere dalle vite e ampiezze relative delle componenti di decadimento. In generale, 4 porte sono sufficienti per monoesponenziale montaggio decade mentre 7 o più porte puòessere utilizzato per più modelli di decadimento complessi.
Notiamo che FLIM può essere implementato utilizzando una serie di tecniche nel dominio del tempo o nel dominio della frequenza e HCA FLIM automatizzata di matrici piastra pozzetti è stata implementata prima di una (non sezionamento) in tutto il campo ottico con letture a vita nel dominio della frequenza di FRET 51. La prima ottica sezionamento FLIM lettore di piastre pozzetti automatizzato per HCA l'utilizzo in tutto il campo di tempo-dipendenti di imaging 28 è stato poi riportato. Successivamente, a grande campo (non sezionamento) nel dominio della frequenza FLIM HCA è stato applicato per lo screening per le modifiche post-traslazionali (tirosin-fosforilazione) attraverso una libreria gene utilizzando FRET 52 e il tempo-dipendenti FLIM HCA è stato applicato a preoccuparsi saggi di HIV-1 gag oligomerizzazione 53 e di SUMOylation di FoxM1 54 e di Raichu RhoA e Rac1 biosensori 33. E 'anche possibile utilizzare TCSPC per piastra di pozzetti FLIM 26, ma fino ad oggi si è dimostrato difficile da abbinare tegli throughput tecniche che sfruttano il rilevamento a grande campo. Un approccio emergente che potrebbe affrontare questo problema è l'uso di matrici di rivelatori singoli conteggio di fotoni come array SPAD 55.
Notiamo che eventuali letture di FRET utilizzando proteine fluorescenti devono essere trattati con cautela e che i valori assoluti dei parametri ottenuti da FLIMfit o qualsiasi altro software di analisi FLIM dipenderà dalle ipotesi associati al modello raccordo. Per esempio, dove il donatore FRET ha una significativa componente secondo decadimento, l'uso di un modello biesponenziale per adattarsi ai dati FRET FLIM può comportare il contributo della componente più veloce decadimento, tipicamente associati con la popolazione FRETing appare superiore a quello che dovrebbe. E 'quindi desiderabile impiegare donatori con una vita mono-esponenziale, come mTq2FP. Anche allora, recenti studi hanno dimostrato che l'analisi FRET può ancora essere influenzata da stati scure di proteine accettore di fluorescenza o dieterogeneità del fattore orientamento κ 2 a causa di una distribuzione di conformazioni fluoroforo con una varietà di angoli cromofori e distanze 56. Tuttavia, noi e altri hanno dimostrato che le letture di fluorescenza a vita di FRET producono risultati utili che correlano con le misurazioni biochimiche e possono essere utilizzati per lo screening per le interazioni proteina o di seguire la dinamica di biosensori. Così questa piattaforma HCA openFLIM può essere applicata a una vasta gamma di test di durata a base di fluorescenza utilizzando FRET o autofluorescenza cellulare 8, oltre a fornire letture quantitativi di sonde a base di coloranti 25.
The authors have nothing to disclose.
The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.
microscope frame | Olympus | IX81 | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
optical autofocus | Olympus | ZDC | http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf |
motorized (x-y-z) microscope stage | Marzhauser | 00-24-565-0000 | Stage with Corvus controlle |
excitation laser source | Fianium | SC400-4 | Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/ |
gated optical intensifier | Kentech | High Rate Imager (HRI) | |
delay generators | Kentech | — | See agile delay generator and precision delay generator |
camera | Hamamatsu | ORCA-ER-II | |
Nipkow disc scanner unit | Yokogawa | CSU-X1 | http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/ |
Top hat diffuser | Thorlabs | ED1-S20-MD | Engineered diffusers |
mTq5V | Oxford Genetics | P3850 | mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker |
mTq17V | Oxford Genetics | P3847 | mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker |
mTq32V | Oxford Genetics | P3848 | mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker |
mTq5A | Oxford Genetics | P3849 | mTurquoise Amber construct |
HEK293T | — | — | cell type used |
phenol red-free HBSS | Sigma Aldrich | 55021C-1000ML | imaging media |
culture media | DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics | ||
DMEM | Sigma Aldrich | D6046-500ML | for culture media |
FBS | Sigma Aldrich | 12003C-500ML | for culture media |
xTremeGene9 | Sigma Aldrich | 6.37E+09 | for transfection, follow online protocol from La Roche |
trypsin/EDTA Solution | Thermo Fischer | R001100 | for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer |