Imaging cellulare dal vivo e analisi 3D del recettore dell'angiotensina di tipo 1a tratta degli transfettati embrionali umane cellule renali Utilizzando Microscopia confocale
Summary
Qui vi presentiamo un protocollo per celle di immagine che esprimono fluorescenti tipo angiotensina recettori 1a proteina-tag verde durante endocitosi avviate dal trattamento angiotensina II. Questa tecnica comprende lisosomi etichettatura con un secondo marcatore fluorescente, e quindi utilizzando software per analizzare la co-localizzazione di recettori e lisosomi in tre dimensioni nel tempo.
Abstract
Live-cell imaging è usata per acquisire contemporaneamente time-lapse immagini di recettori di tipo angiotensina 1a (AT 1a R) e compartimenti intracellulari in cellule embrionali umane del rene trasfettate-293 (HEK) dopo stimolazione con angiotensina II (Ang II). Cellule HEK sono transitoriamente trasfettate con il DNA plasmide contenente AT 1a R contrassegnate con maggiore proteina fluorescente verde (EGFP). Lisosomi sono identificati con un colorante fluorescente rosso. Le immagini in diretta delle cellule vengono catturati su una scansione laser microscopio confocale dopo stimolazione Ang II e analizzati dal software in tre dimensioni (3D, voxel) nel corso del tempo. live-cell imaging consente indagini traffico recettore ed evita confonde associati con fissaggio, in particolare, la perdita o spostamento artefatti di recettori di membrana EGFP-tag. Così, come singole cellule sono tracciati nel tempo, la localizzazione subcellulare dei recettori può essere ripreso e misurato. Le immagini devono essere acquisite sufficiently rapidamente per catturare il movimento delle vescicole rapida. Tuttavia, a velocità di imaging più veloce, il numero di fotoni raccolti è ridotta. Compromessi devono essere effettuate anche nella selezione dei parametri di imaging come la dimensione voxel per ottenere velocità di esposizione. applicazioni significative di live-cell imaging sono di studiare il traffico di proteine, la migrazione, la proliferazione, ciclo cellulare, apoptosi, l'interazione autofagia e proteina-proteina e dinamiche, per citarne solo alcuni.
Introduction
L'obiettivo generale è quello di ottenere dati quantitativi nel tempo e nello spazio dei recettori colocalizzazione con specifici organelli subcellulari dopo il trattamento con un agonista del recettore. Così, l'obiettivo immediato è quello di catturare time-lapse immagini confocale di lisosomi e un transmembrana spanning recettore in cellule renali embrionali umane (HEK) dopo trasfezione e da montare successivamente e analizzare i dati di imaging in 3D per misurare quantitativamente la consegna del recettore lisosomi. Indagare il traffico simultaneo di un recettore transmembrana con i lisosomi o altri organelli durante endocitosi quando attivato dal recettore ligando può aiutare a determinare come il recettore transmembrana è regolato in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.
AT 1a R si presume essere degradato nei lisosomi dopo il trattamento con Ang II in sistemi di cellule modello, soprattutto HEK293 1, anche se la maggior parte dei receptors sono principalmente localizzate in endosomi riciclaggio multivesicular per il riciclaggio successivamente alla membrana plasmatica mentre la massa del legante, Ang II, è degradata nel lisosoma 2, 3, 4, 5. Più recentemente, Li et al. dimostrata mediante trasferimento di Förster energia di risonanza (FRET) e la fluorescenza di imaging durata microscopia (FLIM) tecniche che colocalizza AT 1a R (on ~ 10 nm scala) LAMP1, una proteina di membrana lisosomiale suggerendo che almeno una parte del recettore colpisce selettivamente e degradate da lisosomi 6. Questi autori hanno notato che la clorochina inibitore lisosomiale bloccato a 1A associazione R-LAMP1 che è coerente con le precedenti relazioni che suggeriscono che un effetto di clorochina è quello di bloccare la fusione di endosomi ritardo o autofagosomi con i lisosomi. Altri approcci indiretti per determinare a 1a R localization in lisosomi hanno utilizzato bafilomicina, un inibitore lisosomiale inferire AT 1a presenza R in lisosomi 3, 4, 5, 6, 7, 8.
live-cell imaging evita potenziali effetti di fissazione su volume cellulare, e la perdita / oscuramento / ridistribuzione dei recettori GFP-chimerico. Studi precedenti hanno invocato cellule fissate per determinare colocalizzazione o co-occorrenza del recettore con i lisosomi o usando cellule vive marcate con surrogati recettore-legante come β-arrestina 1, 2, 3, 4, 5, 6. live-cell imaging di altri GPCR utilizzando confocale disco rotante o laser a scansione punto confmicroscopi Ocal dotati di Gaasp o HYD rilevatori hanno permesso ai ricercatori di osservare l'internalizzazione e la tratta dei recettori in singole cellule imaged in z-stack a 30 s intervalli 9, 10. Tuttavia, anche quando z-stack cellule vive sono rapidamente raccolti, analisi può avvenire solo dopo la selezione di un singolo piano all'interno di ciascuna pila, cioè in 2D 10. Anche se questo potrebbe essere sufficiente per studiare il GPCR o tirosin-chinasi del recettore internalizzato in questione, i Rs 1A a accumula in vescicole che cambiano dimensioni e la posizione nel tempo e, quindi, sono intrinsecamente più difficili da campionare in modo adeguato con una fetta solo rappresentante in ogni punto. Per determinare accuratamente il percorso del marcato a 1A R attraverso la cella e per rilevare ogni sottopopolazione di vescicole che differiscono in termini di dimensioni e la posizione, abbiamo messo a punto un metodo per l'imaging 3D e l'analisi 3D per tenere traccia di questi cambiamenti e di essere usato insieme con etichettatura di diversi compartimenti intracellulari come lisosomi.
Gli investigatori possono utilizzare questo protocollo per live-cell imaging di visualizzare direttamente il movimento di AT 1a R nella cella e il suo trasferimento a compartimenti subcellulari dopo stimolazione Ang II. compartimenti cellulari sono contrassegnati con chimere proteina fluorescente o altri marcatori fluorescenti. Questo protocollo può essere utilizzato anche come un primo approccio per localizzare recettori organelli subcellulari con una risoluzione minima di 200 nm per comparare mutato rispetto recettori wild-type o per rilevare modifiche seguenti trattamenti farmacologici. La tecnica è accessibile poiché può essere effettuata su ogni microscopio confocale attrezzata per live-cell imaging. La relativa facilità di questo approccio contrasta con maggiore competenza e le attrezzature necessarie per svolgere FRET / FLIM / tecniche BRET che rilevano interazioni molecolari 6,"xref"> 11. Queste misure definiscono le interazioni proteina-proteina ad alta risoluzione (~ 10 nm) e la localizzazione all'interno di organelli subcellulari è dedotto. Queste tecniche più avanzate sono utilizzate per seguire e definire ulteriormente le interazioni molecolari di interesse, piuttosto che il passaggio dei recettori attraverso compartimenti subcellulari, e dimostrano direttamente interazioni proteina-proteina in tempi e luoghi specifici all'interno della cella 11. FLIM, una tecnica FRET indipendente dalla concentrazione di accettori, viene spesso eseguita su campioni corretti dopo l'acquisizione dell'immagine è più lento. Al contrario, il rapporto FRET fornisce una rapida delle immagini e ad alta risoluzione colocalization di proteine che interagiscono. Lo svantaggio di rapporto di FRET è che l'imaging utilizza widefield epi-fluorescenza per guadagnare velocità di imaging e di includere l'intera cella, con conseguente ridotta risoluzione e contrasto degli organelli 12. trasferimento di energia di risonanza bioluminescenza (BRET) è un altrotecnica avanzata che è stato applicato al GPCRs per misurare l'acquisizione di prossimità molecolare nel tempo 11. In questa tecnica un fluoroforo proteina è molecolarmente diviso e ciascuna metà collegato ad uno dei due proteine in questione. Quando le due proteine di interesse legano tra loro, le parti del tag chimerico riassemblare acquisire fluorescenza e la maggiore fluorescenza quantificato nel tempo.
Qui vi presentiamo una tecnica semplice per l'imaging dal vivo di cellule accoppiato con immagine quantificazione di studiare il traffico di AT 1a R nella cella in seguito a stimolazione Ang II e il potenziale cambiamento nella consegna di interiorizzato a 1A R per lisosomi seguenti stimolazione Ang II. L'uso finale per questa tecnica è quello di caratterizzare le differenze di traffico di membrana confronto wild type e recettori mutati. Queste differenze aiuteranno a identificare il meccanismo (s) che hanno un impatto le attività fisiologiche di AT 1a R leading di regolazione della pressione sanguigna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esperimenti preliminari qui presentati mostrano che nel corso di un piuttosto breve corso di tempo di 24 min, senza modificare sensibilmente la consegna di AT 1a R-GFP ai lisosomi si è verificato. In generale, la consegna dei recettori internalizzati ai lisosomi potrebbe verificarsi già 15-20 min. Questo esperimento è coerente con l'ipotesi che la maggior parte del interiorizzato a 1A R si rivolge a grandi, endosomi perinucleari. La prova che almeno alcuni AT 1a R arriva in lisoso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro di ricerca presentato in questo manoscritto è stato sostenuto dalla concessione R01 HL121456-01A1 a Kathryn Sandberg. Questo lavoro è stato sostenuto in aggiunta dalla disponibilità di una Leica SP8 AOBS in microscopia e di imaging di risorse condivise (MISR) presso la Georgetown University Medical Center, che è parzialmente finanziato da P30-CA051008 dal National Institutes of Health degli Stati Uniti d'America. Noi riconosciamo con gratitudine Leica assistenza di imaging SP8 da Peter Johnson, e l'uso della Zeiss LSM880 nel laboratorio di Thomas Coate, Dipartimento di Biologia presso la Georgetown University con l'assistenza di imaging fornita da Alma Arnold di Carl Zeiss Microscopia LLC. Il contenuto di questo manoscritto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
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