Imagens de células vivas e Análise 3D da angiotensina Receptor Tipo Tráfico 1a em células do rim Transfectados embrionárias humanas usando microscopia confocal
Summary
Aqui apresentamos um protocolo para células de imagens que expressam receptores verdes fluorescentes marcado com proteína de tipo angiotensina 1a durante a endocitose iniciadas por tratamento angiotensina II. Esta técnica inclui lisossomas rotulagem com um segundo marcador fluorescente, e em seguida, utilizando software para analisar a co-localização do receptor e lisossoma em três dimensões ao longo do tempo.
Abstract
Processamento de imagem de células vivas é usado para capturar simultaneamente imagens de lapso de tempo de receptores do tipo angiotensina 1a (AT 1a R) e compartimentos intracelulares em células embrionárias humanas transfectadas renal-293 (HEK) após estimulação com angiotensina II (Ang II). HEK são transitoriamente transfectadas com DNA plasmídeo contendo AT 1a R marcado com reforçada proteína verde fluorescente (EGFP). Os lisossomas são identificados com um corante fluorescente vermelho. imagens ao vivo de células são capturados num microscópio confocal de varrimento laser, após a estimulação de Ang II e analisadas por software em três dimensões (3D), voxels ao longo do tempo. processamento de imagem de células vivas, permite investigações de tráfico receptor e evita confunde associados com a fixação, e em particular, a perda ou o deslocamento artefactual de receptores de membrana de EGFP-marcados. Assim, como as células individuais são rastreados através do tempo, a localização subcelular de receptores pode ser representada por imagem e medido. As imagens devem ser adquiridas sufficiently rapidamente para capturar o movimento vesícula rápida. No entanto, a velocidades mais rápidas de imagem, o número de fotões recolhidos é reduzida. Compromissos também deve ser feita na seleção de parâmetros de imagem como o tamanho do voxel, a fim de ganhar velocidade de imagem. aplicações significativas de processamento de imagem de células vivas estão a estudar proteína tráfico, migração, proliferação, ciclo celular, apoptose, autofagia e proteína-proteína interação e dinâmica, para citar apenas alguns.
Introduction
O objectivo global é obter evidência quantitativa em tempo e espaço de co-localização do receptor com organelas subcelulares específicos após o tratamento com um agonista do receptor. Assim, o objectivo imediato aqui é capturar lapso de tempo imagens confocais de lisossomas e um transmembranar abrangendo receptor em células de rim embrionário humano (HEK) a seguir à transfecção e de montar posteriormente e analisar os dados de imagem em 3D para medir quantitativamente a entrega do receptor de lisossomos. Investigando o tráfico simultânea de um receptor transmembranar com lisossomos ou outras organelas durante a endocitose quando ativado por ligando de receptor pode ajudar a determinar a forma como o receptor de membrana é regulada sob condições fisiológicas e fisiopatológicas.
EM 1a R é presumido ser degradado nos lisossomas, após tratamento com Ang II em sistemas celulares modelo, principalmente HEK293 1, embora a maioria dos receptors estão localizados principalmente em endossomas de reciclagem multivesiculares para posterior reciclagem para a membrana plasmática, enquanto a maior parte do ligando, a Ang II, é degradado no lisossoma 2, 3, 4, 5. Mais recentemente, Li et al. demonstrada utilizando transferência de Förster de energia de ressonância (FRET) e microscopia de imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM) técnicas que a 1A R colocaliza (em ~ 10 nm escala) com LAMP1, uma proteína de membrana lisossomal o que sugere que pelo menos algum do receptor está voltado para e degradada por lisossomas 6. Estes autores observaram que a cloroquina inibidor lisossômico bloqueado na 1a associação R-LAMP1 que é consistente com relatórios anteriores que sugerem que um efeito da cloroquina é bloquear fusão de endossomas tardios ou autofagossomas com lisossomos. Outras abordagens indiretas para determinar AT 1a R localization nos lisossomos têm utilizado bafilomicina, um inibidor lisossômico para inferir AT 1a presença R nos lisossomos 3, 4, 5, 6, 7, 8.
processamento de imagem de células vivas evita potenciais efeitos de fixação sobre o volume das células e perda / escurecimento / redistribuição de receptor GFP-quimérico. Estudos anteriores têm invocado células fixas para determinar colocalização ou co-ocorrência do receptor com lisossomas ou utilizando células vivas marcadas com substitutos de ligação ao receptor, como β-arrestina 1, 2, 3, 4, 5, 6. processamento de imagem de células vivas de outros GPCRs usando confocal disco giratório ou laser conf ponto de leituramicroscópios ocal equipados com detectores de Gaasp ou HYD habilitado investigadores para observar a internalização e tráfico de receptores em células individuais fotografada em z-stacks em 30 s intervalos de 9, 10. No entanto, mesmo quando células z-stacks vivo são recolhidos rapidamente, análise só pode ocorrer após a seleção de um único plano dentro de cada pilha, ou seja, em 2D 10. Embora isso possa ser suficiente para estudar o receptor quinase GPCR ou tirosina internalizado em questão, os Rs 1-A em acumula em vesículas que mudam de tamanho e posição ao longo do tempo e, portanto, são inerentemente mais difícil de provar de forma adequada usando uma fatia único representante em cada ponto de tempo. Para determinar completamente a rota do rotulada a 1a R através da célula e detectar cada subpopulação de vesículas que diferem em tamanho e posição, temos desenvolvido um método para geração de imagens 3D e análise 3D para acompanhar essas mudanças e ser utilizado em conjunto com a rotulagem de vários compartimentos intracelulares, tais como os lisossomas.
Os investigadores podem utilizar este protocolo para geração de imagens ao vivo de células de visualizar diretamente o movimento de AT 1a R dentro da célula e sua transferência para compartimentos subcelulares após a estimulação Ang II. compartimentos subcelulares são marcados com quimeras proteínas fluorescentes ou outros marcadores fluorescentes. Este protocolo pode também ser utilizado como uma primeira abordagem para localizar receptores em organelos subcelulares com uma resolução mínima de 200 nm a fim de comparar mutado contra os receptores de tipo selvagem ou para detectar alterações seguintes tratamentos farmacológicos. A técnica é acessível, uma vez que pode ser realizado em qualquer microscópio confocal equipado para processamento de imagem de células vivas. A relativa facilidade desta abordagem contrasta com o aumento da experiência e equipamento necessário para levar a cabo / FLIM técnicas FRET / BRET que detectam interacções moleculares 6,"xref"> 11. Estas medições definir interacções proteína-proteína com uma resolução elevada (~ 10 nm) e localização dentro organelos subcelulares é inferida. Estas técnicas mais avançadas são usadas para acompanhar e definir melhor as interações moleculares de interesse, em vez de a passagem de receptores através de compartimentos subcelulares, e eles demonstram diretamente interações proteína-proteína em horários e locais específicos dentro da célula 11. FLIM, uma técnica de FRET independente da concentração de aceitador, é mais frequentemente realizada em amostras fixadas desde aquisição de imagem é mais lenta. Em contraste, a relação FRET fornece imagens rápida e co-localização de alta resolução de proteínas que interagem. A desvantagem de relação de FRET é que a imagem utiliza widefield epi-fluorescência para ganhar velocidade de imagem e incluir toda a célula, resultando na redução da resolução e contraste de organelas 12. transferência de bioluminescência de energia de ressonância (BRET) é outraavançada técnica que tem sido aplicado aos GPCRs para medir a aquisição de proximidade molecular ao longo do tempo 11. Nesta técnica, um fluoróforo proteína molecularmente é dividida e cada metade ligada a uma das duas proteínas em questão. Quando as duas proteínas de interesse ligam-se um ao outro, as partes da etiqueta quimérico voltar a montar para a aquisição de fluorescência e o aumento da fluorescência ao longo do tempo quantificada.
Aqui, apresentamos uma técnica simples para geração de imagens ao vivo de células juntamente com quantificação imagem para estudar o tráfico de AT 1a R na célula com a estimulação Ang II e da alteração potencial de entrega de internalizado AT 1a R para lisossomos após a estimulação Ang II. A utilização final para esta técnica é para caracterizar diferenças de tráfico membrana comparando tipo selvagem e mutantes receptores. Estas diferenças ajudará a identificar o mecanismo (s) que o impacto atividades fisiológicas da AT 1a R leading a regulação da pressão arterial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentos preliminares aqui apresentados mostram que ao longo de um curso de tempo bastante curto de 24 min, nenhuma mudança significativa na prestação de AT 1a R-GFP para os lisossomos ocorreu. Em geral, a entrega de receptores internalizados para os lisossomas pode ocorrer tão cedo quanto 15-20 min. Esta experiência é consistente com a hipótese de que a maior parte da AT internalizado 1a R é voltado para grandes perinucleares, endossomas. A prova de que, pelo menos, alguns em 1a</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho de pesquisa apresentado neste manuscrito foi apoiado pela concessão R01 HL121456-01A1 para Kathryn Sandberg. Este trabalho foi apoiado além da disponibilidade de uma Leica SP8 AOBS na Microscopia e recursos partilhada Imagem (MISR) a Georgetown University Medical Center, que é parcialmente financiado pelo P30-CA051008 dos Institutos Nacionais de Saúde dos Estados Unidos da América. Agradecemos Leica assistência imagem SP8 por Peter Johnson, eo uso da Zeiss LSM880 no laboratório de Thomas Coate, do Departamento de Biologia da Universidade de Georgetown com a ajuda de imagens fornecido pela Alma Arnold da Carl Zeiss Microscopia LLC. O conteúdo deste manuscrito é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
