공 초점 현미경을 사용하여 트랜 인간 배아 신장 세포의 라이브 셀 이미징 및 3D 분석 안지오텐신 수용체의 유형 (1A)의 인신 매매
Summary
여기에서 우리는 안지오텐신 II 치료에 의해 시작 엔도 시토 시스 동안 녹색 형광 단백질 태그 안지오텐신 형 1A 수용체를 발현하는 이미지 세포에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 시간이 지남에 따라 입체적 수용체 리소좀의 공동 현지화를 분석하는 소프트웨어를 이용하여 다음 라벨링 제 형광 마커 리소좀 등을 포함한다.
Abstract
라이브 셀 이미징 동시에 안지오텐신 II (중앙 II) 자극 다음 형질 전환 된 인간 배아 신장 293 (HEK) 세포에서 안지오텐신 1a 형의 (1A의 R AT) 수용체 및 세포 내 구획의 시간 경과 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다. HEK 세포를 일시적으로 플라스미드 DNA 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 태그 (1A)의 R AT 함유 형질. 리소좀은 빨간색 형광 염료로 식별됩니다. 라이브 셀 이미지는 중앙 II 자극 후 레이저 스캐닝 공 초점 현미경에 포착 시간이 지남에 따라 세 가지 차원 (3D, 복셀)에서 소프트웨어로 분석된다. 라이브 세포 이미징 수용체 피킹으로 조사 할 수 있으며 정착과 관련된 교란을 방지하고, 특히, EGFP 태그가 막 수용체의 손실 또는 artefactual 변위. 각 셀은 시간을 추적 같이 따라서, 수용체의 세포 내 지역화 묘화하고 측정 할 수있다. 이미지는 sufficientl을 취득해야합니다Y는 빠른 속도로 빠른 소포의 움직임을 촬영합니다. 그러나, 빠른 속도로 영상을 수집 된 광자의 수는 감소된다. 절충안은 이미징 속도를 얻기 위해 같은 복셀 사이즈 촬상 파라미터의 선택에서 이루어져야한다. 라이브 세포 이미징의 중요한 응용 프로그램 이름하지만 몇 가지로 단백질 인신 매매, 이동, 증식, 세포주기, 세포 사멸, 자식 작용 및 단백질 – 단백질 상호 작용과 역학을 공부한다.
Introduction
전반적인 목표는 수용체 작용제 치료 후 시간과 특정 세포 내 소기관과 수용체의 colocalization을의 공간에서 정량적 증거를 획득하는 것입니다. 따라서, 여기에 즉시 목표 경과 촛점 리소좀의 이미지와 인간 배아 신장 세포에서 수용체 (HEK) 정량적으로 수용체의 전달을 측정하기 위하여 3 차원의 화상 데이터를 형질 다음이어서 조립 분석 걸친 트랜스를 캡처하는 리소좀. 횡단 수용체가 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에 의해 규제되는 방법을 결정하는 데 도움이 수용체 리간드에 의해 활성화되면 세포 내 이입 동안 리소좀 또는 다른 세포 소기관이있는 횡단 수용체의 동시 인신 매매를 조사.
1A AT R 주로 HEK293 촬영 한 대부분 있지만, 모델 전지 시스템의 중앙 II로 처리 다음 리소좀 저하 될 것으로 추정된다리간드, 앙 II의 대량 리소좀 2, 3, 4, 5의 열화 상태 eptors 주로 세포막 나중에 재활용 multivesicular 재활용 엔도 좀에 편재되어있다. 최근 리튬 등. 포스터 공명 에너지 전이 (FRET) 및 형광 수명 이미징 현미경 (FLIM) 기술을 이용하여 증명하는 AT 1A는 R의 colocalizes LAMP1으로 (~ 10 nm의 척도), 리셉터의 적어도 일부에 타겟팅 및 열화되는 것을 제안 리소좀 막 단백질 리소좀 (6)에 의해. 이 저자는 리소좀 억제제 클로로퀸은 클로로퀸의 효과가 리소좀 늦은 엔도 좀 또는 autophagosomes의 융합을 차단하는 것을 제안 이전 보고서와 일치 1A R-램프 1 협회에서 차단 지적했다. 기타 간접 접근 (1A)의 R 리터 AT 결정리소좀에서 ocalization는 리소좀 3, 4, 5, 6, 7, 8 (1A)의 R의 앞에서 추론 리소좀 억제제 bafilomycin 이용했다.
라이브 셀 이미징은 세포 부피 및 GFP-키메라 수용체의 손실 / 디밍 / 재배포에 고정의 잠재적 영향을 방지 할 수 있습니다. 이전 연구 colocalization을하거나 또는 리포좀 등의 수용체 – 결합 대용 표지 생균 사용에 수용체의 동시 발생을 결정 고정 세포 의존 한 β-아레스 1, 2, 3, 4, 5, 6. 회전 디스크 공 촛점 또는 레이저 포인트 스캐닝의 conf를 사용하여 다른 된 GPCR의 라이브 셀 이미징하나로 이루어질 수 또는 HYD 탐지기가 장착 OCAL 현미경은 30 초 간격으로 9, 10 Z-스택에 몇 군데 개별 세포 수용체의 내면화와 인신 매매를 관찰하는 연구자 수있었습니다. 라이브 세포 Z – 스택이 빠르게 수집 그러나 경우에도, 분석은 2D (10)에 즉 각 스택 내에서 단일 평면 선택 후 발생할 수 있습니다. 이 문제의 내재화 GPCR 또는 티로신 키나제 수용체 공부 충분할 수도 있지만, AT 1A는 루피는 시간의 크기와 위치를 변화함으로써 본질적으로 적절하게 각 시점에서 대표적인 단일 슬라이스를 이용하여 시료에 더 어렵 소체에 축적한다. 철저히 셀 통해 크기 및 위치에 다른 소포 각 모집단을 검출하는 1A의 R AT 분류의 경로를 결정하기 위해, 3 차원 영상 및 3 차원 분석을위한 방법은 이러한 변화를 추적하고되도록 고안 이러한 리소좀 등 다양한 세포 내 구획의 표시와 함께 사용.
수사관들은 직접 셀과 중앙 II 자극 다음 세포 내 구획에 그 이전에 AT 1A는 R의 움직임을 시각화하는 라이브 세포 이미징에 대해이 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 세포 내 구획 형광 단백질 키메라 또는 다른 형광 마커 태그. 이 프로토콜은 또한 야생형 수용체 대 비교하는 돌연변이 또는 약물 치료를 다음과 같이 변경을 검출하기 위해 200 nm의 최소 해상도 세포 내 소기관의 수용체를 지역화하는 첫 번째 방법으로 사용될 수있다. 이 라이브 셀 이미징 구비하는 공 초점 현미경에 대해 수행 될 수 있기 때문에이 기술은 액세스. 이 방법의 상대적인 용이성이 증가 전문성과 상호 작용 분자 (6)을 검출 FRET / FLIM / BRET 기술을 수행하는 데 필요한 장비와 대조"외부 참조"> 11. 이러한 측정은 높은 해상도 (~ 10 ㎚)과 세포 내 소기관 내 위치 파악이 유추됩니다에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 정의합니다. 이러한 고급 기술은 후속 또한 분자 관심 작용보다는 세포 내 구획을 통해 수용체 통로를 정의하는 데 사용되며, 이들은 직접 셀 (11) 내에서 특정 시간과 장소에서 단백질 – 단백질 상호 작용을 보여준다. 화상 취득이 느리기 때문에 FLIM, 억 셉터 농도에 독립적 인 FRET 기술은 주로 고정 된 샘플들에 수행된다. 대조적으로, 비 FRET 빠른 영상과 상호 작용하는 단백질의 고해상도 colocalization을을 제공한다. 비 FRET의 단점은 이미징 위드 에피 형광 이미징 속도를 얻기 위해 감소 해상도 및 세포 기관 (12)의 대조 결과 전체 셀을 포함를 활용한다. 생물 발광 공명 에너지 전달 (BRET)는 다른 인시간 (11)를 통해 분자 근접의 인수를 측정하기 된 GPCR에 적용된 고급 기술. 이 기술에서, 단백질 형광 분자는 분할되고, 각 반 당해 두 단백질 중 하나에 연결. 되면 관심 바인드 두 단백질 서로 키메라 태그의 부분은 형광 시간 동안 정량 증가 형광 취득 조립 재.
여기서 우리는 중앙 II 자극과 중앙 II 자극을 다음과 리소좀에 1A의 R AT 내면화 전달의 전위 변화에 따라 셀에 AT 1A는 R의 인신 매매를 연구하는 이미지 정량화와 결합 라이브 세포 이미징을위한 간단한 방법을 제시한다. 이 기술의 궁극적 인 사용은 야생형과 돌연변이 수용체를 비교 막 인신 매매의 차이를 특성화하는 것입니다. 이러한 차이는 AT 1A는 R leadi는을의 생리 활성 메커니즘 (들)에 영향을 파악하는 데 도움이 될 것입니다혈압 조절 ng 내지.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 예비 실험은 24 분의 비교적 짧은 시간 과정 동안, 리소좀에 AT의 1A R-GFP의 전달에는 상당한 변화가 발생하지 않았 음을 보여줍니다. 일반적으로 리소좀에 내면화 수용체의 전달은 빠르면 15 ~ 20 분으로 발생할 수 있습니다. 이 실험은 1A의 R AT 내면화의 대부분이 큰, 핵 주변 엔도 좀을 대상으로 가설과 일치한다. R은 리소좀에 도착 1A AT 적어도 일부는 리 등…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 논문에 제시된 연구 작업은 캐서린 샌드버그에 부여 R01 HL121456-01A1에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 미국의 국립 보건원 (National Institutes of Health)에서 P30-CA051008에 의해 자금 지원 조지 타운 대학 의료 센터에서 현미경 및 이미지 공유 자원 (MISR)에 라이카 SP8 AOBS의 가용성에 의해 추가로 지원되었다. 우리는 기꺼이 라이카 SP8 영상 피터 존슨 안내, 칼 자이스 현미경 LLC의 알마 아놀드가 제공하는 영상 지원과 조지 타운 대학의 토마스 Coate, 생물학과의 실험실에서 자이스 혈구 LSM880의 사용을 인정합니다. 이 원고의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
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