Levende celler og 1a 3D Analyse af angiotensin receptor type handel i transfekterede humane embryoniske nyreceller Brug konfokalmikroskopi
Summary
Her præsenterer vi en protokol til billedet celler, der udtrykker grønt fluorescerende protein-mærket angiotensin typen 1a-receptorer under endocytose igangsat af angiotensin II-behandling. Denne teknik omfatter mærkning lysosomer med et andet fluorescerende markør, og derefter anvender software til at analysere co-lokalisering af receptor og lysosomer i tre dimensioner over tid.
Abstract
Live-cell imaging bruges til samtidig at indfange time-lapse billeder af angiotensin typen 1a-receptorer (AT 1a R) og intracellulære rum i transfekterede humane embryonale nyre-293 (HEK) celler efter stimulation med angiotensin II (Ang II). HEK-celler transient transficeret med plasmid DNA indeholdende AT 1a R tagget med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP). Lysosomer er identificeret med et rødt fluorescerende farvestof. Levende-celle bliver optaget på en laser konfokalt efter Ang II stimulering og analyseret ved software i tre dimensioner (3D, voxels) over tid. Live-cell imaging giver undersøgelser receptor menneskehandel og undgår andre variable forbundet med fiksering, og især tab eller kulturgenstandsspor fortrængning af EGFP-mærkede membranreceptorer. Således som individuelle celler spores gennem tiden, den subcellulære lokalisering af receptorer kan afbildes og måles. Billeder skal erhverves sufficiently hurtigt at indfange hurtige vesikel bevægelse. Men ved hurtigere billeddannelse hastigheder, er antallet af fotoner indsamlede reduceret. Kompromiser skal også gøres i udvælgelsen af imaging parametre som voxel størrelse for at få billeddannelseshastighed. Væsentlige anvendelser af live-cell imaging er at studere protein trafficking, migration, proliferation, cellecyklus, apoptose, autofagi og protein-protein-interaktion og dynamik, for blot at nævne nogle få.
Introduction
Det overordnede mål er at få kvantitative beviser i tid og rum af receptor colokalisering med specifikke subcellulære organeller efter behandling med en receptor agonist. Således umiddelbare mål her er at fange time-lapse konfokale billeder af lysosomer og en transmembranomspændende receptor i humane embryoniske nyreceller (HEK) efter transfektion og efterfølgende at samle og analysere billeddata i 3D til kvantitativ måling levering af receptoren til lysosomer. Undersøgelse samtidig handel med en transmembrane receptor med lysosomer eller andre organeller under endocytose når det aktiveres af receptor ligand kan hjælpe med at bestemme, hvordan den transmembrane receptor reguleres under fysiologiske og patofysiologiske forhold.
AT 1a R formodes at blive nedbrudt i lysosomer efter behandling med Ang II i modelsystemer celler systemer, primært HEK293 1 selvom størstedelen af receptors primært lokaliseret i multivesikulære genanvendelse endosomer til senere genanvendelse til plasmamembranen, mens størstedelen af liganden, Ang II, nedbrydes i lysosomer 2, 3, 4, 5. For nylig Li et al. påvist under anvendelse Forster-resonansenergioverførsel (FRET) og fluorescens levetid imaging mikroskopi (FLIM) teknikker, AT 1a R colocalizes (på ~ 10 nm skala) med LAMP1, et lysosomalt membranprotein antyder, at i det mindste nogle af receptoren er målrettet til og nedbrudt af lysosomer 6. Disse forfattere bemærkede, at lysosomale inhibitor chloroquin blokeret AT 1a R-LAMP1 forening, der er i overensstemmelse med tidligere rapporter tyder på, at en effekt af chloroquin er at blokere fusion af sene endosomer eller autophagosomes med lysosomer. Andre indirekte metoder til at bestemme AT 1a R localization i lysosomer har udnyttet bafilomycin, en lysosomal inhibitor at udlede AT 1a R tilstedeværelse i lysosomer 3, 4, 5, 6, 7, 8.
Live-cell imaging undgår potentielle virkninger af fiksering på celle volumen, og tab / dæmpning / omfordeling af GFP-kimære receptor. Tidligere undersøgelser har påberåbt fikserede celler til bestemmelse colokalisering eller samtidig forekomst af receptoren med lysosomer eller brug af levende celler mærket med receptorbindende surrogater, såsom β-arrestin 1, 2, 3, 4, 5, 6. Live-cell imaging af andre GPCR'er ved hjælp roterende skive konfokal eller laser punkt scanning confocal mikroskoper udstyret med Gaasp eller Hyd detektorer aktiveret efterforskere at observere internalisering af og handel med receptorer i de enkelte celler afbildet i z-stakke med 30 s intervaller 9, 10. Men selv når levende celle z-stakke hurtigt opsamles, kan analysen kun ske efter valget af en enkelt plan inden for hver stak, dvs. i 2D 10. Mens dette kan være tilstrækkelig til at studere internaliseret GPCR eller tyrosinkinasereceptor pågældende, AT-1a Rs akkumuleres i vesikler, der ændrer størrelse og placering over tid og er således ifølge sagens natur mere vanskeligt i tilstrækkelig grad prøve under anvendelse af en repræsentativ enkelt skive på hvert tidspunkt. At grundigt fastlægge, hvilken rute af det mærkede AT 1a R gennem cellen og til at opdage hver delpopulation af vesikler forskellige i størrelse og placering, har vi udviklet en metode til 3D-billeder og 3D-analyse for at spore disse ændringer, og at være anvendes i forbindelse med mærkning af forskellige intracellulære rum såsom lysosomer.
Efterforskere kan bruge denne protokol for live-cell imaging til direkte visualisere bevægelse AT 1a R ind i cellen og dens overførsel til subcellulære rum efter Ang II stimulering. Subcellulære afsnit er mærket med fluorescerende proteinkimærer eller andre fluorescerende markører. Denne protokol kan også anvendes som en første tilnærmelse til lokalisering receptorer i subcellulære organeller med en minimum opløsning på 200 nm for at sammenligne muteret versus vildtype-receptorer eller til at detektere ændringer efter farmakologiske behandlinger. Teknikken er tilgængelig, da den kan udføres på en hvilken som helst konfokalt mikroskop udstyret til live-cell imaging. Den relative lethed af denne tilgang i kontrast med øget ekspertise og nødvendige udstyr til at udføre FRET / FLIM / Bret teknikker, som detekterer molekylære interaktioner 6,"xref"> 11. Disse målinger definerer protein-protein-interaktioner med høj opløsning (~ 10 nm) og lokalisering inden subcellulære organeller er udledt. Disse mere avancerede teknikker bruges til at følge op og yderligere at definere molekylære interaktioner af interesse, snarere end passagen af receptorer gennem subcellulære rum, og de direkte demonstrere protein-protein interaktioner på bestemte tidspunkter og steder i cellen 11. FLIM, en FRET teknik uafhængig af acceptor koncentration, er oftest udført på faste prøver, da billedet erhvervelse er langsommere. I modsætning hertil forholdet FRET tilvejebringer hurtig billeddannelse og høj opløsning colokalisering af interagerende proteiner. Ulempen ved forholdet FRET er, at billedbehandling udnytter Vidvinklet epi-fluorescens at få billedbehandling hastighed og til at omfatte hele cellen, hvilket resulterer i reduceret opløsning og kontrast af organeller 12. Bioluminescens resonans energioverførsel (BRET) er en andenavanceret teknik, som har været anvendt på GPCR'er at måle erhvervelse af molekylære lighed over tid 11. I denne teknik et protein fluorofor er molekylært delt og hver halvdel knyttet til en af to proteiner pågældende. Når de to proteiner af interesse binder hinanden, de dele af det kimære tag saml at erhverve fluorescens og den øgede fluorescens kvantificeret over tid.
Her præsenterer vi en enkel teknik til live-cell imaging kombineret med billedet kvantificering at studere handel med AT 1a R i cellen på Ang II stimulering og den potentielle ændring af levering af internaliseret AT 1a R til lysosomer efter Ang II stimulation. Den endelige anvendelse for denne teknik er at karakterisere forskelle i membranen trafficking sammenligner vildtype og muterede receptorer. Disse forskelle vil bidrage til at identificere den mekanisme (r), som påvirker fysiologiske aktiviteter i AT 1a R leading til regulering af blodtrykket.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indledende forsøg præsenteret her viser, at over en temmelig kort tidsforløb for 24 min, ingen mærkbar ændring i leveringen af AT 1a R-GFP til lysosomerne indtraf. Generelt kunne levering af internaliserede receptorer til lysosomer forekomme så tidligt som 15-20 min. Dette eksperiment er i overensstemmelse med den hypotese, at hovedparten af den internaliserede AT 1a R er målrettet til store, perinukleære endosomer. Dokumentation for, at i det mindste nogle AT 1a R ankommer i lys…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen arbejde præsenteres i dette manuskript blev støttet af tilskud R01 HL121456-01A1 til Kathryn Sandberg. Dette arbejde blev støttet ud af tilgængeligheden af en Leica SP8 AOB'er i og Billeddannelse Shared Resource (MISR) ved Georgetown University Medical Center, som er delvist finansieret af P30-CA051008 fra National Institutes of Health i USA. Vi takker Leica SP8 imaging assistance af Peter Johnson, og brugen af Zeiss LSM880 i laboratoriet af Thomas Coate, Biologisk Institut ved Georgetown University med imaging bistand fra Alma Arnold Carl Zeiss Microscopy LLC. Indholdet i dette manuskript er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Angiotensin II (Ang II) | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 11960-044 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Penicillin Streptomycin (Pen Strep) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Warm in 37 °C water bath before use |
| L-Glutamine 200mM (100X) | Gibco (life technologies) | 25030-081 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Human Embryonic Kidney (HEK)-293 cells | American Type Culture Collection (ATCC) | CRL-1573 | Passage number 5 -12 |
| Nunc Lab-Tek II chambered 1.5 German Coverglass System | Sigma-Aldrich | 155409 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher Scientific | 11668019 | Store at 4 °C |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco- ThermoFisher Scientific | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PBS 10X | Fisher BioReagents | BP3994 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Dulbecco's Modified Eagle medium (DMEM 1X) | Gibco -ThermoFisher Scientific | 31053-028 | Warm in 37 °C water bath before use |
| LysoTracker Red DND-99 | molecular probes -ThermoFisher Scientific | L7528 | Store aliquotes in dark at -20 °C . |
| Volocity Ver. 6.3 Image Analysis software | PerkinElmer | Visualization and Quantitation Modules | For 3D image analysis of image stacks |
| Leica SP8 AOBS | Leica Microsystems | laser scanning confocal microscope | For image collection |
| Zeiss LSM 880 | Carl Zeiss | laser scanning confocal microscope | For image collection |
References
- Dale, L. B., Seachrist, J. L., Babwah, A. V., Ferguson, S. S. Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention, degradation, and recycling by Rab5, Rab7, and Rab11 GTPases. J Biol Chem. 279 (13), 13110-13118 (2004).
- Hein, L., Meinel, L., Pratt, R. E., Dzau, V. J., Kobilka, B. K. Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol Endocrinol. 11 (9), 1266-1277 (1997).
- Hunyady, L., et al. Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. J Cell Biol. 157 (7), 1211-1222 (2002).
- Lazari, M. F., Porto, C. S., Freymuller, E., Abreu, L. C., Picarelli, Z. P. Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem Pharmacol. 54 (3), 399-408 (1997).
- Li, H., Li, H. F., Felder, R. A., Periasamy, A., Jose, P. A. Rab4 and Rab11 coordinately regulate the recycling of angiotensin II type I receptor as demonstrated by fluorescence resonance energy transfer microscopy. J Biomed Opt. 13 (3), 031206 (2008).
- Li, H., et al. Actin cytoskeleton-dependent Rab GTPase-regulated angiotensin type I receptor lysosomal degradation studied by fluorescence lifetime imaging microscopy. J Biomed Opt. 15 (5), 056003 (2010).
- Yamamoto, A., et al. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23 (1), 33-42 (1998).
- Deliu, E., Tica, A. A., Motoc, D., Brailoiu, G. C., Brailoiu, E. Intracellular angiotensin II activates rat myometrium. Am J Physiol Cell Physiol. 301 (3), C559-C565 (2011).
- Fortian, A., Sorkin, A. Live-cell fluorescence imaging reveals high stoichiometry of Grb2 binding to the EGF receptor sustained during endocytosis. J Cell Sci. 127 (Pt 2), 432-444 (2014).
- Aymerich, M. S., et al. Real-time G-protein-coupled receptor imaging to understand and quantify receptor dynamics. ScientificWorldJournal. 11, 1995-2010 (2011).
- Jaeger, W. C., Armstrong, S. P., Hill, S. J., Pfleger, K. D. Biophysical Detection of Diversity and Bias in GPCR Function. Front Endocrinol (Lausanne). 5, 26 (2014).
- Inuzuka, T., et al. Attenuation of ligand-induced activation of angiotensin II type 1 receptor signaling by the type 2 receptor via protein kinase. C. Sci Rep. 6, 21613 (2016).
- Liu, J., et al. Selective inhibition of angiotensin receptor signaling through Erk1/2 pathway by a novel peptide. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (8), R619-R626 (2014).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Mueller, S. C., Hubbard, A. L. Receptor-mediated endocytosis of asialoglycoproteins by rat hepatocytes: receptor-positive and receptor-negative endosomes. J Cell Biol. 102 (3), 932-942 (1986).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Freundt, E. C., Czapiga, M., Lenardo, M. J. Photoconversion of Lysotracker Red to a green fluorescent molecule. Cell Res. 17 (11), 956-958 (2007).
- Yoshimori, T., Yamamoto, A., Moriyama, Y., Futai, M., Tashiro, Y. Bafilomycin A1, a specific inhibitor of vacuolar-type H(+)-ATPase, inhibits acidification and protein degradation in lysosomes of cultured cells. J Biol Chem. 266 (26), 17707-17712 (1991).
