לא פולשני<em> בויבו</em> פלואורסצנטי הדמיה אופטית של פעילות MMP דלקתית באמצעות Activatable פלואורסצנטי סוכן הדמיה
Summary
מאמר זה מסביר את היישום של הדמיה פלואורסצנטי באמצעות בדיקת הדמיה אופטית activatable לדמיין את הפעילות vivo של metalloproteinases מטריצה מפתח בשני מודלים ניסיוניים שונים של דלקת.
Abstract
מאמר זה מתאר שיטה לא פולשנית metalloproteinases מטריצה הדמיה (MMP) – פעילות על ידי בדיקה פלואורסצנטי activatable, באמצעות in vivo פלואורסצנטי הדמיה אופטית (OI), בשני מודלים עכבר שונים של דלקת: דלקת מפרקים שגרונית (RA) ואיש קשר מודל תגובה רגישות (CHR). אור עם אורך גל בחלון אינפרא אדום הקרוב (NIR) 650 – 950 ננומטר) מאפשר חדירת רקמה עמוקה יותר וקליטה אות מינימלית לעומת אורכי גל מתחת 650 ננומטר. היתרונות העיקריים באמצעות פלואורסצנטי OI היא שזה זול, מהיר וקל ליישם דגמים שונים של בעלי חיים.
בדיקות ניטור Activatable הם שתיקה אופטית במדינות שלהם מומת, אבל להיות מאוד פלורסנט כאשר מופעל על ידי פרוטאז. הופעל MMPs להוביל להרס רקמות לשחק תפקיד חשוב להתקדמות המחלה בתגובות hyperersensitivity סוג מתעכב (DTHRs) כגון RA ו CHR. יתר על כן, MMPs הםאת פרוטאזות מפתח עבור סחוס העצם השפלה והם המושרה על ידי מקרופאגים, fibroblasts ו chondrocytes בתגובה לציטוקינים פרו דלקתיים. כאן אנו משתמשים בדיקה כי הוא מופעל על ידי MMPs מפתח כמו MMP-2, -3, -9 ו -13 ו לתאר פרוטוקול הדמיה עבור קרוב הקרינה אינפרא אדום OI של פעילות MMP ב RA ו עכברים שליטה 6 ימים לאחר אינדוקציה המחלה גם כן כמו בעכברים עם אקוטי (1x אתגר) וכרוני (5x אתגר) CHR על האוזן הימנית לעומת האוזניים בריא.
Introduction
מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA) או vulgaris פסוריאזיס מדורגות כמו תגובות של רגישות יתר מסוג מתעכב (DTHRs). RA 1 היא מחלה אוטואימונית נפוצה המאופיינת סינוביטיס מכרסמת והרס המפרק. 2 דלקת מפרקים מוסתים להפגין חדירה והתפשטות של תאי דלקת, ביטוי מוגבר של תאי פרו-דלקתיים מובילים להיווצרות pannus, סחוס והרס עצם. מחשוף 3, 4 של מולקולות תא מטריקס, כגון קולגן על ידי metalloproteinases מטריצה (MMPs), הוא חיוני עבור המרת רקמות אנגיוגנזה וגורם הרס רקמות. 5, 6 תגובות רגישות-יתר לתקשר (CHR) מאופיין צבירה של נויטרופילים שמובילים פרץ חמצונים. 7 בדומה RA, MMPs ב CHR הם involVed ב המרה רקמות, הגירה תא אנגיוגנזה על מנת ליצור דלקת כרונית.
כדי לחקור RA, גלוקוז 6-פוספט איזומראז (GPI) – סרום מזרק עכבר המודל שימש. 8 סרום מעכברים K / BxN מהונדס המכיל נוגדנים נגד GPI, הוזרק לתוך BALB / עכברים c נאיבי לאחר מכן דלקת ראומטית החלה להתפתח בתוך 24 שעות עם מקסימום של נפיחות בקרסול ביום 6 לאחר הזרקה בסרום GPI (ראה 1.1). כדי לנתח CHR כרונית, C57BL / 6 עכברים היו רגיש עם trinitrochlorobenzene (TNCB) על הבטן. האוזן הימנית נתגלתה עד 5 פעמים החל משבוע לאחר הרגישות (ראה גם 1.1 ו -1.2).
Noninvasive חיה קטנה OI היא טכניקה המבוססת על in vivo החקירה של אותות ניאון, chemiluminescent ו- bioluminescent, אשר משמשים בעיקר במחקר פרה קליני. הנתונים הכמותיים הנרכשים מספקים תובנות למולקמנגנוני ular באיברים ורקמות של בריא כמו גם במודלים של בעלי חיים חולים ניסיוני, ומאפשר האורך מעקב מדידות (למשל להעריך פרופילים בתגובה טיפוליים in vivo). יתרון גדול של מחקרים ארוכים טווח הוא ההפחתה של מספרי בעלי חיים, כמו באותן החיות ניתן למדוד במחקרי מעקב במספר נקודות זמן במקום להשתמש בעכברים שונים לכל נקודת זמן. הרזולוציה של OI מאפשרת הדמיה תפקודית מפורטת של איברים ואף מבני רקמות קטנים יותר בחיות מעבדה.
השימוש מסנן עירור ופליטה ספציפי עם ספקטרום שידור צר, הגנה נגד אור מפוזר על ידי lightproof "תיבה כהה" ואת מכשיר טעון מצמידים רגיש (CCD) מצלמה, אשר מקורר במכשירים רבים עד -70 ° C , מאפשר מאוד מדידות ספציפיות ורגישות של אותות הקרינה.
באמצעות סוכני ניאון עם excitation- ופליטה-ספקטרה בחלון הקרינה האינפרה-אדום הקרוב (650 – 950 ננומטר), אות-לרעש ניתן לשפר יחסים משמעותיים. חלון הקרינה האינפרה-אדום הקרוב מתאפיין קליטה נמוכה יחסית של האות על ידי ההמוגלובין ומים וכן קרינה אוטומטית רקע נמוך. 9 זה מאפשר עומק החדירה של עד 2 ס"מ רקמות של חיות קטנות. OI-בדיקות יכולות לטפל יעד ישירות (למשל על ידי נוגדן הנקרא קרינה) או יכולות להיות מופעלת ברקמת היעד (למשל על ידי פרוטאזות). בדיקות OI Activatable שותקים אופטיים בצורתם המומתת בשל העברת אנרגית תהודת פורסטר (סריג) כדי מחצית מרווה, אשר מעבירה את אנרגית העירור בתוך מולקולת לתחום אחר. אם הצבע הוא ביקע (על ידי הפרוטאז למשל) האנרגיה כבר לא יועברו בתוך המולקולה אות ניאון יכול להיות מזוהים על ידי OI. זה מאפשר תכנון של בדיקות OI עם specificit גבוההy עבור תהליכים ביולוגיים ברורים אות לרעש-יחסים מעולים.
הפרוטוקול הבא מסביר בפירוט על הכנת החיות, מדידות OI באמצעות בדיקת OI Activatable לתמונת MMP-2, -3, -9 ו -13 פעילות in vivo ושני דגמים ניסיוניים של דלקת (RA, CHR).
Protocol
Representative Results
Discussion
OI הוא כלי מאוד שימושי, מהיר ולא יקר עבור פולשני בתחום ההדמיה המולקולרית vivo במחקר פרה-קליניים. חוסנה החברתי בפרט של OI הוא היכולת לנטר תהליכים דינמיים מאוד כמו תגובות דלקתיות. יתר על כן, OI מאפשר לעקוב אחר מהלך מחלה במשך תקופה ארוכה של זמן, החל מספר ימים עד שבועו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים דניאל Bukala, נטלי Altmeyer ו Funda קיי לקבלת תמיכה טכנית מעולה. אנו מודים יונתן גפן, גרג באודן ופול Soubiran לעריכת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי ורנר סימנס-קרן והפקולטה לרפואה של אוניברסיטת טובינגן אברהרד Karls ( "" Promotionskolleg "") ועל ידי DFG דרך 156 CRC (C3 הפרויקט).
Materials
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
- Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
- Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
- Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
- Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. The K/BxN arthritis model. Curr Protoc Immunol. 15, 22 (2008).
- Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
- Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
- Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3′-deoxy-3′-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
- Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
- Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
- Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3′-deoxy-3′-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
- Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3′-[18F]fluoro-3′-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
- Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
- Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
- Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
- Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
- McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
- Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
- Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
- Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
- Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
- Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
- Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
- Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).
