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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Nicht-invasiv Published: May 8, 2017 doi: 10.3791/55180
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University of Tübingen, 2Department of Nuclear Medicine, Eberhard Karls University of Tübingen, 3Department of Dermatology, Eberhard Karls University of Tübingen

Summary

Dieses Papier beschreibt die Anwendung von Fluoreszenz - Bildgebung einer aktivierbare optische Abbildungssonde mit der in vivo Aktivität von Schlüsseln Matrixmetalloproteinasen in zwei verschiedenen Versuchsmodellen der Entzündung zu visualisieren.

Abstract

Dieses Papier beschreibt ein nicht-invasives Verfahren zur Abbildung von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) -Aktivität durch eine aktivierbare Fluoreszenzsonde über in vivo Fluoreszenz-optische Bildgebung (OI) in zwei verschiedenen Mausmodellen der Entzündung: eine rheumatoide Arthritis (RA) und einen Kontakt Hypersensitivitätsreaktion (CHR) Modell. Licht mit einer Wellenlänge im nahen Infrarot (NIR) Fenster (650 - 950 nm) ermöglicht eine tiefere Gewebepenetration und minimale Signalabsorption im Vergleich zu Wellenlängen unter 650 nm. Die großen Vorteile mit Fluoreszenz OI ist, dass es billig, schnell und einfach in verschiedenen Tiermodellen zu implementieren ist.

Aktivierbare Fluoreszenzsonden sind in ihren inaktivierten Zuständen optisch leise, werden aber bei der Aktivierung durch eine Protease stark fluoreszierend. Aktivierte MMPs führen zur Gewebezerstörung und spielen eine wichtige Rolle für die Progression von Krankheiten bei verzögerten Hypersensitivitätsreaktionen (DTHRs) wie RA und CHR. Darüber hinaus sind MMPsDer Schlüssel Proteasen für Knorpel- und Knochenabbau und wird von Makrophagen, Fibroblasten und Chondrozyten in Reaktion auf proinflammatorische Cytokine induziert. Hier verwenden wir eine Sonde, die durch die Schlüssel MMPs wie MMP-2 aktiviert wird, -3, -9 und -13, und ein Bildgebungsprotokoll für Nah-Infrarot-Fluoreszenz OI der MMP-Aktivität in RA und Kontroll-Mäuse 6 Tage nach der Krankheitsinduktion beschreiben und wie bei Mäusen mit akuter (1x Herausforderung) und chronische (5x Herausforderung) CHR am rechten Ohr im Vergleich zu gesunden Ohren.

Introduction

Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis (RA) oder Psoriasis vulgaris werden als verzögerte Hypersensitivitätsreaktionen (DTHRs) eingestuft. 1 RA ist eine gemeinsame Autoimmunerkrankung, die durch erosive Synovitis und Gelenkzerstörung gekennzeichnet ist. 2 Inflamed arthritische Gelenke zeigen Infiltration und Proliferation von entzündlichen Zellen, eine erhöhte Expression von entzündungshemmenden Zellen, die zu Pannusbildung, Knorpel und Knochenzerstörungen führen. 3 , 4 Die Spaltung von extrazellulären Matrixmolekülen wie Kollagen durch Matrixmetalloproteinasen (MMPs) ist für die Gewebeumwandlung und Angiogenese essentiell und verursacht Gewebezerstörungen. 5 , 6 Kontaktüberempfindlichkeitsreaktionen (CHR) zeichnen sich durch Aggregation von Neutrophilen aus, die zu einem oxidativen Burst führen. 7 Ähnlich wie bei RA sind MMPs in CHR involviertved in Gewebeumwandlung, Zellmigration und Angiogenese, um eine chronische Entzündung zu etablieren.

Um zu untersuchen, RA, die Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) -Serum Injektionsmausmodell verwendet wurde. 8 Serum aus transgenen K / B × N - Mäuse - Antikörpern gegen GPI enthält, wurde in naiven BALB / c - Mäuse injiziert , nach der rheumatischen Entzündungen innerhalb von 24 h mit maximal Knöchelschwellung am Tag 6 nach der GPI-Seruminjektion (siehe 1.1) zu entwickeln begann. chronischen CHR, C57BL / 6-Mäuse wurden mit Trinitrochlorbenzol (TNCB) sensibilisiert auf dem Bauch zu analysieren. Das rechte Ohr wurde auf 5 mal beginnend 1 Woche nach der Sensibilisierung in Frage gestellt (siehe auch 1.1 und 1.2).

Noninvasive Kleintier OI ist eine Technik , basierend auf die in - vivo - Untersuchung von Fluoreszenz-, chemiluminescent- und Biolumineszenz-Signalen, die in der präklinischen Forschung hauptsächlich verwendet werden. Die erworbenen semi-quantitativen Daten geben Einblicke in die molecular Mechanismen in den Organen und Geweben von gesunden als auch erkrankten experimentellen Tiermodellen und Längs ermöglicht Messungen verfolgen (zB therapeutische Reaktion Profile in vivo zu bewerten). Ein großer Vorteil der Langzeitstudien ist die Verringerung der Anzahl der Tiere, wie die gleichen Tiere können in Folgestudien zu mehreren Zeitpunkten anstelle der Verwendung von verschiedenen Mäusen pro Zeitpunkt gemessen werden. Die Auflösung von OI ermöglicht eine detaillierte funktionelle Bildgebung von Organen und sogar kleinere Gewebestrukturen bei Versuchstieren.

Die Verwendung spezieller Anregungs- und Emissionsfilter mit einem schmalen Transmissionsspektrum, ein Schutz gegen Streulicht durch eine lichtundurchlässigen „Dunkelkammer“ sowie ein sensitiver Charged-Coupled Device (CCD) -Kamera, die in vielen Geräten bis -70 ° C abgekühlt wird, ermöglicht hochspezifische und empfindliche Messungen von Fluoreszenzsignalen.

Durch die Verwendung von Fluoreszenzmitteln mit Anregungs- undEmissionsspektren im Nah-Infrarot-Fluoreszenzfenster (650 - 950 nm) können Signal-Rausch-Verhältnisse deutlich verbessert werden. Das Nah-Infrarot-Fluoreszenzfenster zeichnet sich durch eine relativ geringe Absorption des Signals durch Hämoglobin und Wasser sowie eine niedrige Hintergrund-Auto-Fluoreszenz aus. 9 Dies ermöglicht eine Eindringtiefe von bis zu 2 cm im Gewebe von kleinen Tieren. OI-Sonden können direkt ein Ziel adressieren ( zB durch einen fluoreszenzmarkierten Antikörper) oder im Zielgewebe ( zB durch Proteasen) aktiviert werden. Aktivierbare OI-Sonden sind aufgrund ihrer Förster-Resonanz-Energieübertragung (FRET) in ihrer inaktivierten Form optisch schweigend zu einer Quench-Einheit, die die Anregungsenergie im Molekül in eine andere Domäne überträgt. Wenn der Farbstoff gespalten wird (z. B. durch eine Protease), wird die Energie nicht mehr innerhalb des Moleküls übertragen und ein Fluoreszenzsignal kann von OI detektiert werden. Dies ermöglicht die Konstruktion von OI-Sonden mit hohem spezifischemY für unterschiedliche biologische Prozesse und ausgezeichnete Signal-Rausch-Verhältnisse.

Das folgende Protokoll erläutert im Detail die Vorbereitung der Tiere, die OI-Messungen unter Verwendung einer aktivierbaren OI-Sonde zur Abbildung der MMP-2, -3, -9 und -13-Aktivität in vivo und zwei experimentelle Modelle der Entzündung (RA, CHR).

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Protocol

Alle Verfahren in diesem Papier beschrieben, folgten die Richtlinien und internationale Standards der Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der lokalen Tierschutz und Tierethikkommission des Land Kommission Tübingen, Deutschland zugelassen. 8 bis 12 Wochen alt BALB / c und C57BL / 6-Mäuse gehalten wurden auf einem 12 h: 12 h Licht: Dunkel-Zyklus und wurden in IVCs und standardisierten Umweltbedingungen bei 22 ± 1 ° C in Gruppen von 2 untergebracht - 5 mit Wasser und Lebensmittel Zugang ad libitum.

1. Material Vorbereitung

  1. Verdünne die OI-Farbstoff für Nah-Infrarot-Fluoreszenzabbildung entsprechend dem jeweiligen Datenblatt unmittelbar vor der Injektion. Der aktivierbare OI Farbstoff (Handel Sonde mit einer Anregung bei 680 nm) MMPs in vivo zu messen , ist bereit , in einer Konzentration von 20 nmol in 1,5 ml 1x PBS zu verwenden. Vorsichtig schütteln oder die Lösung vor der Verwendung vortexen. für bis zu 6 Monate 8 ° C unter Lichtschutz - OI Farbstoff kann bei 2 gespeichert werden. Für intravenöse ( iv ) Injektionen bereiten wir einen venösen Katheter vor. Verwenden Sie eine 20 U (0,5 ml) Insulinspritze, gefüllt mit 0,9% Kochsalzlösung (mit 10 Injektionseinheiten von Heparin in 50 ml) und einer 30-Gauge-Nadel, die an einem Polyethylen-Katheter befestigt ist. Injektion der empfohlenen Dosis von 2 nmol pro Maus des OI-Farbstoffs.

2. Induktion von rheumatoider Arthritis und chronischer Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion

  1. Rheumatoide Arthritis:
    1. Verdünnen Sie 100 μl Serum (gewonnen aus K / BxN-Mäusen 10 ), die Antikörper (AB) gegen Glucose-6-phosphat-Isomerase (GPI) 1: 1 mit 1x PBS (200 μL) enthalten, um RA zu induzieren. Das verdünnte Serum bei -80 ° C aufbewahren. Detaillierte Verfahren zur Induktion von RA werden von Monach et al. 8
    2. Um RA zu induzieren, heben Sie jede Maus sanft an den Schwanz und injizieren 200 μl des verdünnten Serums intraperitoneal ( ip ) am Tag 0 von tEr experimentiert. Nach der Injektion die Maus direkt zurück in den Käfig bringen.
    3. Wahlweise messen Sie die Knöchel-Durchmesser jedes Knöchels, vor AB-Injektionen und definieren eine "arthritische Punktzahl" (Abbildung 1A ). Fortsetzung der Messung der Knöchelschwellung täglich bis zum Tag 6 nach GPI-Serum mit einem mechanischen Messgerät (Mikrometer).
    4. Injizieren Sie den aktivierbaren OI-Farbstoff (Schritt 1.1 - 1.2), um die vivo- MMP-Aktivität iv in die Schwanzvene von RA-Mäusen zu messen Am Tag 5 nach GPI-Serum-Injektion und in die Schwanzvene von Kontrollmäusen. Führen Sie optische Bilderzeugungsexperimente 24 h nach der Schwanzveneninjektion durch.
  2. Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion:
    1. Zur Sensibilisierung von C57BL / 6-Mäusen wird eine 5% ige TNCB-Lösung, gelöst in einer 4: 1-Mischung aus Aceton / Öl, hergestellt.
    2. Anaesthetize C57BL / 6 Mäuse mit 1,5% Isofluran verdampft in 100% Sauerstoff (1,5 l / min). Sobald die Mäuse anästhesiert sind, legen Sie sie in eine Selbstverrückte E-Nase-Konus (eine geschnittene 5 ml Polyethylen-Spritze, die mit dem 1,5 Vol .-% Isofluran-Rohr verbunden ist) und die Anästhesie aufrecht zu erhalten. Tragen Sie Tierarzneimittel auf anästhesierte Tiere auf, um die Trockenheit der Augen zu verhindern, während sie anästhesiert werden.
    3. Rasieren Sie den Bauch vorsichtig (2 x 2 cm) mit einem kleinen Tierhaarschneider. Vermeiden Sie es, die Haut zu verletzen, da dies zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen im Tier führen kann und die Ergebnisse der Studie beeinflussen kann.
    4. 80 μl der 5% TNCB-Lösung langsam auf den rasierten Abdomenbereich mit einer 100 μl Pipette auftragen, um das Tier zu sensibilisieren. Legen Sie die Maus sanft wieder in den Käfig, wobei darauf geachtet wird, dass die Augen der Maus nicht mit den Bettwaren in Berührung kommen, um Hornhautverletzungen zu vermeiden und niedrige Körpertemperaturen während der Erholungsphase zu vermeiden.
    5. Sechs Tage nach der Sensibilisierung wird eine 1% ige TNCB-Lösung (gelöst in einer 9: 1-Mischung aus Aceton / Öl) hergestellt und 20 μl am rechten Ohr mit einer Pipette aufgetragen, um akute und chronische CHSR hervorzurufen.„> 1
      1. Beginnen Sie mit der 1. Herausforderung auf beiden Seiten des rechten Ohrs mit 20 & mgr; l von 1% TNCB Lösung einer 100 & mgr; l - Pipette und wiederholen Sie die Herausforderung jeden zweiten Tag bis zu fünf Mal (Tag 15 nach der Sensibilisierung) zu entlocken CHR (1B) . Messen Sie Ohrdicke täglich, mit einem Mikrometer Messgerät.
    6. Injizieren Sie den aktivierbare OI Farbstoff (ein handelsübliches Sonde mit einer Anregung bei 680 nm) (Schritt 1,1-1,2) MMP - Aktivität in vivo in Mäusen CHR 12 h nach der Herausforderung zu messen. Führen optische Abbildungs Experimente 24 h nach Injektion in die Schwanzvene (iv).

3. Vorbereitung der Tiere für Optical Imaging

  1. Schalter Mäusefutter (mindestens 3 Tage vor imaging) zu gering oder nicht fluoreszenzFutter (zB Mangan frei) , um die Interferenz von Auto-Fluoreszenz zu vermeiden (um 700 nm) mit dem Fluoreszenzsignal der verwendeten OI Mittel.
  2. Legen Sie das Tier inZu einer Anästhesiebox und betäubt mit 1,5 Vol .-% Isofluran, verdampft mit Sauerstoff (1,5 l / min) (Sauerstoff kann durch Luft ersetzt werden, muss aber innerhalb eines Experiments standardisiert werden).
  3. Wenn die Maus sichtbar anästhesiert wird, legen Sie sie in einen selbstgemachten Nasenkonus (bauen Sie durch eine geschnittene 5 ml Polyethylenspritze, die mit dem 1,5 Vol .-% Isofluranrohr verbunden ist) und pflegt die Anästhesie.
  4. Rasiere das Tier vorsichtig auf dem Zielort (2 cm x 2 cm) mit einem kleinen Tierhaarschneider. Vermeiden Sie es, die Haut zu verletzen, da dies zu unspezifischen Fluoreszenzsignalen im Tier führen kann und die Ergebnisse der Studie beeinflussen kann.
    HINWEIS: Haare können das Fluoreszenzsignal während OI (abhängig vom Mausstamm, mehr oder weniger Absorption beobachtet) abhängig von der Region von Interesse (ROI) absorbieren.
  5. Für iv Injektion, legen Sie den Schwanz der Maus in erwärmtes Wasser, um Vasodilatation zu induzieren, reinigen Sie sanft die Haut an der Injektionsstelle mit Alkohol und beginnen Sie mit dem Platzieren des KathetersDie distale Stelle des Schwanzes Legen Sie die "Schnitt" -Kante der Nadel in einem Winkel von 20 ° in die Schwanzvene und testen Sie die korrekte Platzierung des Katheters durch erneutes Aufhängen der Spritze.
  6. Wenn der Katheter korrekt platziert ist, ersetzen Sie die Spritze und injizieren Sie die OI-Sonde (2 nmol). Nach der Injektion die Spritze austauschen und 25 μl 0,9% Kochsalzlösung einspritzen, um das Totvolumen des Polyethylenrohres vollständig zu löschen.
    HINWEIS: Die Gewebe-Halbwertszeit des verwendeten OI-Farbstoffs (eine kommerzielle Sonde mit Anregung bei 680 nm) zur Messung der MMP-Aktivität in vivo beträgt 72 h. Um einen vollständigen Abstand zu gewährleisten, wird eine Wiederinjektion des Farbstoffes nicht früher als 7 Tage nach einer vorherigen Injektion empfohlen.

4. Optische Bildgebung

  1. Legen Sie ein schwarzes Plastik- oder Papierblatt in die schwarze Schachtel des OI-Scanners in die Mitte des Gesichtsfeldes (FOV).
  2. Stellen Sie ein Messprotokoll ein und wählen Sie die richtige Wellenlänge (Anregung: 680 ± 10 nm und eAuftrag: 700 ± 10 nm) und Abbildungsparameter.
    HINWEIS: In einigen Systemen OI, das Setup für mehrere Bildfarbstoffe ist vordefiniert.
  3. Um das richtige Protokoll für Fluoreszenz-Imaging zu wählen, öffnen Sie die Imaging-Software (vom Hersteller zur Verfügung gestellt) und das System initialisieren. Die meisten CCD-Kameras benötigen, um ihre Arbeitstemperatur abzukühlen, und diese 10 Minuten dauern kann. Für zuverlässige Ergebnisse, warten, bis das System bereit ist.
  4. Beachten Sie die in vivo - Bildgebungssystem Erfassungs - Steuertafel Pop - up und jedes Filterpaar ausgewählt wird repräsentiert ein Bild in der Sequenz. In diesem Fall erwirbt ein Bild mit den Filterpaaren für die kommerzielle Farbstoff mit und eine Anregungs- und Emissionswellenlänge von 680 ± 10 nm und 700 ± 10 nm, bzw., und startet die Messung (Press „Acquire sequence“). Weitere detaillierte Anweisungen finden Sie in der Betriebsanleitung des Herstellers zu sehen.
  5. Beschriften Sie die Bilder in geeigneter Weise und speichert die Informationen in dem „Bild bearbeitenLabels ", die nach der" Acquire sequence "auftauchen wird.
  6. Nehmen Sie einen Baseline-Scan von jedem Tier vor der Injektion des OI-Farbstoffs, oder verwenden Sie naive Kontrolltiere, um das Hintergrundsignal zu unterscheiden.
  7. H nach der Schwanzveneninjektion des OI-Farbstoffs die Tiere in die Mitte des FOV stellen, in einer Position, um das höchste Signal im OI-System zu messen und die Messungen zu starten.
    HINWEIS: Wichtig: Hypothermie kann die Verteilung der bildgebenden Mittel signifikant beeinflussen. Stellen Sie sicher, dass die Bühne auf 37 ° C erwärmt wird, um eine Unterkühlung des Tieres zu vermeiden. Die Bildgebung kann gleichzeitig mit Tieren in Gruppen von 1 bis 5 Mäusen durchgeführt werden. Wählen Sie die Größe der FOV abhängig von der Anzahl der Tiere zur Messung zur gleichen Zeit. Sie können ein helles Feldbild aufnehmen, um zu prüfen, ob jede Maus sichtbar ist.

5. Datenanalyse

HINWEIS: Führen Sie die Datenanalyse mit der folgenden Bildsoftware durchHerstellerprotokoll

  1. Für Messungen von RA, verwenden Sie die kalibrierte Einheit der Photonenemission, wie in Abbildung 2 gezeigt , während chronische CHSR als Signalintensität in Prozent (Effizienz) dargestellt werden.
  2. Um die ROIs manuell zu zeichnen, verwenden Sie die Werkzeugplatte. Für die Analyse der RA-Bilder verwenden Sie einen standardisierten Kreis, der um das höchste Signal in allen Knöcheln und Pfoten eines jeden Tieres platziert ist. Um die CHSR zu analysieren, platziere die ROIs um das ganze rechte und linke Ohr nach dem hellen Feldbild.
  3. Um die Photonenemission oder die Signalintensitätswerte im geplanten ROI zu messen, drücken Sie "measure". Das System liefert Werte in den gezeichneten ROI für die deskriptive statistische Analyse.

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Representative Results

Rheumatoide Arthritis (RA) in naiven BALB / c - Mäusen zu induzieren, Tiere wurden ip mit Auto-Antikörper injizieren (1: 1 - Verdünnung mit 1 x PBS) gegen GPI am Tag 0. Die maximale Entzündung (Schwellung Knöchel) in diesem GPI-Serum induzierten RA - Modell ist am Tag 6 nach der Injektion 11. Daher 2 nmol des aktivierbaren OI Farbstoff wurde hergestellt und injiziert iv in die Schwanzvene von arthritischen Mäusen und gesunden Kontrolltieren am Tag 5 24 h nach der Injektion (Tag 6), wurden die Mäuse anästhesiert und wie beschrieben in Abschnitt in 3 abgebildet ( Abbildung 1a).

Zu induzieren CHR, C57BL / 6-Mäuse wurden mit 5% TNCB am Tag sensibilisierten 0 am rasierten Bauch. Am 7. Tag nach Sensibilisierung der 1. Herausforderung am rechten Ohr mit 1% TNCB gestartet. Bis zu fünf Herausforderungen (Tag 15) wurden durchgeführt, eine chronische Entzündung zu induzieren. 7 12 h nach dem the letzte Herausforderung, 20 nmol des OI Farbstoff iv injiziert. Am Tag 15, 24 h nach der Injektion wurde OI oben (Abbildung 1B) , beschrieben , durchgeführt.

Abbildung 2 zeigt ein deutlich verbessertes Fluoreszenzsignal in den Hinterpfoten, Knöchel und Vorderpfoten der RA - Maus am Tag 6 nach der Krankheitsinduktion, verglichen Knöcheln zu steuern (Figur 2A). Biodistribution Analyse der MMP-Aktivität in den Organen von RA Mäusen und gesunden Mäusen zeigte ein stark verbessertes Signal in den Hinterpfoten, Knöchel und Vorderpfoten ausschließlich in den Gelenken von RA-Mäusen. Interessanterweise stellten wir fest , ein erhöhte MMP - Signal in beiden Nieren aller gemessenen RA - Mäuse, wenn sie an die Nieren von gesunden Kontrollmäusen verglichen (2A, rechts). Darüber hinaus messen wir eine erhöhte MMP-Signal in der Leber und im Darm unabhängig davon, ob Mäuse, die von RA leiden. Keine Unterschiede zwischen RA und gesunden Mäusen wurden in t gefundenEr Pankreas, Lunge, Milz und Herz.

Während der chronischen CHR (fünf TNCB-Herausforderungen am rechten Ohr) haben wir eine erhöhte MMP-Aktivität auf dem rechten entzündeten Ohr gemessen, verglichen mit dem gesunden linken Kontrollohr (Abbildung 2B ).

So zeigen unsere Daten eine wichtige Rolle der MMP-Aktivität während der Krankheitsprogression bei beiden entzündlichen Erkrankungen.

Toolsets für Biolumineszenz und Fluoreszenz erlauben die Quantifizierung von zB pmol von Fluorochrom oder die Anzahl der Zellen, die Fluoreszenz exprimieren. Die Daten können in 1. Zählungen angezeigt werden: Zeigt eine nicht kalibrierte Messung des auf die Kamera einfallenden Photonen an, 2. Radiance (Photonen): Zeigt eine kalibrierte Messung der Photonenemission in "Photonen / Sekunde / cm 2 / Steradian" an Empfohlen für die Lumineszenz-Bildgebung oder 3. R.Adiant Effizienz (Fluoreszenz): zeigt die Fluoreszenz-Emissionsstrahlung pro Ereignis-Erregungsleistung, empfohlen für Fluoreszenzmessungen.

Ein großer Vorteil beim Arbeiten mit Strahlungseinheiten bei der Analyse von OI-Bildern ist, dass die Kameraeinstellungen während eines Experiments geändert werden können und dies hat keinen Einfluss auf die Bilder selbst oder die gemessenen ROI-Daten, was den Vergleich von Bildern aus verschiedenen IVIS-Systemen ermöglicht.

Der interessierende Bereich (ROI) gibt den spezifischen Bereich des Interesses vom Benutzer in einem optischen Bild an. Die Symbolleiste ermöglicht es, 3 verschiedene ROIs zu zeichnen: Messung (misst die Signalintensität im ROI des Bildes), durchschnittlicher Hintergrund (misst die mittlere Signalintensität im benutzerdefinierten Bereich für den Hintergrund) oder Subjekt ROI (identifiziert ein Subjekttier in ein Bild).

Wenn das Thema disspielt eine hohe unspezifische Hintergrundsignal selbst, der durch Subtrahieren des Hintergrundsignals (ROI) aus dem Ziel-ROI einen Hintergrund-korrigierte Messung ROI erhalten. Stellen Sie das Bild Minimum nahe Null, um die Autofluoreszenz zu bestimmen oder natürlich Hintergrund Lumineszenz im Bild auftreten. Verknüpfen des Bildes auf ein selbstdefinierten (benutzerspezifische) Hintergrundbild (ROI), die in erster Linie mit dem gemessenen spezifischen Bild gemessen wurden.

Semi-quantitative Analysen der Bilder wurden in durch Ziehen standardisierte Regionen von Interesse (ROIs) durchgeführt sowohl arthritische und Knöchel steuern, sowie in entzündeten und gesunden Ohren Leben Bild-Software. Nur deskriptive statistische Analysen wurden in diesem Manuskript auf in - vivo - Daten durchgeführt wird , aufgrund einer unzureichenden Anzahl von Tieren. Analyse der Signalintensität von arthritischen und gesunden Fußgelenken oder Klauen zeigte eine 7-fach erhöhte MMP-Signalintensität in arthritischen gegen Knöcheln zu steuern. Eine 3-fach höhere MMP-Signalintensität wurde in den vorderen Pfoten von arthritischen Mäusen im Vergleich zu denen der gesunden Tiere nachgewiesen (Abbildung 3A ).

Die Analyse der Ohren mit akutem und chronischem CHR im Vergleich zum linken unangefochtenen Kontrollohr zeigte auch nach der ersten Herausforderung ein signifikant erhöhtes MMP-Signal, das nach dem 3. weiter anstieg und bis zur 5. Herausforderung auf dem gleichen Niveau blieb (Abbildung 3B ) . Als Folge der Kontamination mit dem Kontaktallergen auf dem linken Ohr aufgrund des Verkratzens der Mäuse wurde ein leicht erhöhtes MMP-Signal im linken (nicht TNCB herausgeforderten) Kontrollohr bestimmt. Die Ergebnisse zeigen eine wichtige Rolle von MMPs, die durch ein stark erhöhtes Fluoreszenzsignal bei GPI-Arthritis und chronischer Entzündung, gemessen durch OI, hervorgehoben wird.

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Abbildung 1: RA und CHR Modell, Zeitlicher Verlauf der Krankheitsinduktion und Zeitpunkt für OI. (A) Zeitlicher Verlauf der RA - Induktion in BALB / c - Mäusen (B) und chronischer CHR Induktion in C57BL / 6 - Mäusen. Überblick über die jeweiligen in - vivo - Bildgebung Zeitpunkt und zugehörige Einspritzzeitpunkte des OI Farbstoff zur Messung des MMP - Aktivität in beiden Modellen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: MMP OI in RA, CHR und Kontrolltieren. (A) Repräsentative Ergebnisse der gemessenen MMP - Aktivität in einer arthritischen Maus 6 Tage nach dem GPI-Arthritis - Induktion und eine gesunden Kontrollmaus (linke Seite). Signifikant höheres Signal (Strahldichte (p / s / cm 2 / sr)) intDie Sorgfalt wurde im arthritischen im Vergleich zur gesunden Maus beobachtet. Das Bild rechts zeigt die MMP-Aktivität in den Hinterpfoten und umfasst die Knöchel, Vorderpfoten, Pankreas, Lunge, Milz, Herz, Nieren, Leber und Darm einer geopften GPI-Arthritis-Maus nach OI-Farbstoff-Injektion. OI enthüllte ein hohes Signal in den Vorderpfoten, Knöcheln und Hinterpfoten von RA-Mäusen und Leber und Darm, unabhängig davon, ob die Mäuse mit GPI-Serum (RA-Mäuse) oder Kontrollserum (gesunde Kontrollmäuse) injiziert wurden. (B) MMP-Fluoreszenzsignal in Ohren mit chronischem CHR (links) und Kontrolltiere (rechts). Das entzündete rechte Ohr (herausgefordert 5 mal) zeigt ein stark verbessertes Signal im Vergleich zu Kontroll-Ohren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2 <Br /> Abbildung 3: Semi-quantitative Analyse von entflammten und gesunden Klammern und Ohrengewebe mit OI. (A) Semiquantitative Analyse des Fluoreszenzsignals in RA und gesunde Tiere in den Vorderpfoten und Knöchelgelenken. Arthritische Frontpfoten und Knöchelgelenke zeigen ein signifikantes (** p <0,05) (n = 3) höheres MMP-Signal im Vergleich zu gesunden Knöchelgelenken und Frontpfoten. Die Daten werden als Mittelwert ± SD dargestellt. (B) Halbquantitative Analyse der linken und rechten (herausgeforderten) Ohren nach der 1. , 3. und 5. Herausforderung. Das MMP-Signal wird von der ersten bis zur 5. Challenge deutlich erhöht und zeigte bereits eine maximale Signalintensität im rechten herausgeforderten Ohr nach der 3. Herausforderung (** p <0,05) (n = 3) (Kontrollohren sind teilweise mit TNCB verunreinigt Wegen der Mäuse kratzen.Dies produzierte ein verbessertes Signal, das nicht signifikant war). Die Daten werden als Mittelwert dargestellt± SEM. Der t-Test des 2-tailed Students wurde verwendet, um Unterschiede zwischen Entzündungen (GPI-arthritische Knöchel, rechtsbehandelte Ohren) und Kontrolle (Kontrollknöchel, unbehandelte Ohren) für beide Modelle zu analysieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

OI ist ein sehr nützliches, schnelles und kostengünstiges Werkzeug für die nicht-invasive in vivo molekulare Bildgebung in der präklinischen Forschung. Eine besondere Stärke von OI ist die Fähigkeit, hochdynamische Prozesse wie entzündliche Reaktionen zu überwachen. Darüber hinaus erlaubt OI, den Kurs einer Krankheit für einen längeren Zeitraum zu verfolgen, von Tagen bis Wochen.

OI hat mehrere Vorteile gegenüber anderen in vivo -Bildgebungsmodalitäten wie Positronenemissionstomographie (PET) oder Magnetresonanztomographie (MRT), da es sehr zeit- und kostengünstig ist. Eine Hochdurchsatzanalyse mit bis zu fünf Tieren pro Akquisition ist möglich. Darüber hinaus stehen eine Vielzahl von Sonden zur Verfügung, die auf viele verschiedene biologische Prozesse abzielen. 12 Um weitere anatomische Informationen bereitzustellen, kann OI mit anderen bildgebenden Verfahren wie MRT oder Röntgenstrahl kombiniert werden. Eine weitere Einschränkung ist die geringe Gewebeeindringungstiefe im Vergleich zu fUngewöhnliche PET-Bildgebung. Darüber hinaus steht eine große Anzahl von Sonden zur Verfügung, die auf viele verschiedene biologische Ziele abzielen. 12

Effekte der Anästhesie sollten in der In-vivo- Bildgebung nicht unterschätzt werden. Während spezifische Effekte der Anästhesie auf OI-Ergebnisse nicht gut charakterisiert sind, hat unsere Gruppe in mehreren Studien den Einfluss der Anästhesie auf PET-Imaging-Ergebnisse gezeigt. 13 , 14 , 15 Zum Beispiel haben Fuchs et al. Analysierte Blutparameter wie pCO 2 , pH und Laktat vor und nach PET-Scans unter Verwendung unterschiedlicher Atem- und Anästhesieprotokolle. Es wurde gezeigt, dass signifikante Veränderungen in pCO 2 und Laktatspiegel im betäubten im Vergleich zu bewussten Sauerstoff- oder Luftatmungsmäusen zu signifikanten Veränderungen der PET-Ergebnisse führten. 14 Sie schließen, dass dieser Effekt hauptsächlich durch Sauerstoffatmung und Subsequenz verursacht wirdt zu respiratorischer Azidose bei Tieren, um die verschiedenen Ergebnisse in der PET-Bildgebung führt.

Die Standardisierung der Anästhesie Parameter, wie O 2 -Konzentrationen und Dosen von Anästhetika, sowie Vermeidung von Hypothermie Hilfe systematische Fehler zu vermeiden. Natürlich ist OI 9 durch physikalische Eigenschaften wie zB Lichtstreuung, Gewebeautofluoreszenz und Lichtdämpfung begrenzt. Mehrere Gruppen , diese Probleme ansprechen , indem sie mit anderen Techniken wie in vivo Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie die makroskopischen Ergebnisse von OI kombiniert.

In - vivo - Bildgebung der MMP - Aktivität von MMP-spezifisch aktivierbare fluoreszierenden Sonden wurde in mehreren experimentellen Modellen der Entzündung wie CHS, 7 , sondern auch bei Erkrankungen wie cerebrale Ischämie, 16 Aortenaneurysmen, 17 Myokardinfarkt 18Und atherosklerotische Plaques 19 sowie verschiedene Tumormodelle. 20

Zum Beispiel haben Cortez-Retamozo et al. Untersuchte die in vivo- Aktivität von MMPs in einem Modell einer allergischen Atemwegsentzündung durch Injektion einer MMP-aktivierbaren Sonde, 24 h nach intranasaler Applikation von Ovalbumin in zuvor sensibilisierten Mäusen. 21 Um die Position der MMP-Aktivität weiter zu identifizieren, kombinierte diese Gruppe die tomographische OI, die NIR-Faseroptik-Bronchoskopie und die intravitale Mikroskopie, um den Verlauf der Erkrankung und die Behandlungsreaktion genauer zu überwachen. 21

Andere Ansätze zur Messung der in vivo- MMP-Aktivität verwenden überwiegend Inhibitoren von MMP, die an die aktive Stelle von MMPs binden. McIntyre et al. Beschrieben eine in vivo- Tumor-assoziierte MMP-7-Detektion unter Verwendung eines "polymerbasierten fluorogenen Substrats", das als ein "Proteolyt" wirktIC-Beacon "für MMPs in einem Maus-Xenotransplantat-Modell 22 Sie zeigen, dass die Aktivität von MMP-7 selektiv durch optische Bildgebung nachgewiesen werden konnte. 23 Ferner untersuchten Olson et al. " Aktivierbare zellpenetrierende Peptide "(ACPPs), die in der Lage sind Ziel viele Xenotransplantat-Tumormodelle, kann aber nicht in die Zelle adsorbieren, bis der Linker proteolytiert ist. Sie untersuchten ACPPs, die selektiv für MMP-2 und MMP-9 sind

Die Markierung von MMP-Inhibitoren mit radioaktiven Isotopen für die Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) oder die PET-Bildgebung wurde verwendet, um die MMP-Expression in der Atherosklerose 26 und Krebs 27 zu untersuchen. In einer neueren Studie wurde ein fluoreszenzmarkierter MMP-Inhibitor mit einer MMP-aktivierbaren Sonde verglichen. 28 Der fluoreszenzmarkierte MMP-Inhibitor zeigte ein geringeres Signal zum RauschenVerhältnis im Vergleich zu einer aktivierbaren Sonde, erforderte jedoch eine kürzere Aufnahmezeit.

Neue Biomarker zur Beurteilung der Schlüsselmerkmale der Pathophysiologie können von OI genutzt und validiert werden. Zum Beispiel ist die Antwort auf gefährheitsbezogene molekulare Muster (DAMPs) ein frühes Ereignis während einer entzündlichen Reaktion. Vogl et al. Verwendet einen Cy5.5-markierten Antikörper gegen Alarmin S100A9 bei Modellen der akuten Ohrhautdermatitis, Kollagen-induzierter Arthritis und Infektion mit Leishmania major , um empfindliche Biomarker für frühe Anzeichen einer Entzündung zu entwickeln. 29

Abschließend stellt OI eine schnelle und effiziente Methode für die präklinische Forschung dar, die in der Lage ist, neue Mechanismen von Krankheiten in vivo aufzudecken, neuartige molekulare Ziele zu charakterisieren und therapeutische Effekte zu überwachen . Trotzdem könnte ein nachfolgender Validierungsprozess mit quantitativeren Techniken wie PET erforderlich sein.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Wir danken Daniel Bukala, Natalie Altmeyer und Funda Cay für einen ausgezeichneten technischen Support. Wir danken Jonathan Cotton, Greg Bowden und Paul Soubiran das Manuskript für die Bearbeitung. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung und der Medizinischen Fakultät der Eberhard Karls Universität Tübingen ( ‚‘ Promotions ‚‘) und von der DFG durch den CRC 156 (Projekt C3) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cornergel Gerhard Mann GmbH 1224635 ophthalmic ointment 
Forene Abbott GmbH 4831850 isoflurane
U40 insulin syringe Becton Dickinson and Company 324876
Heparin Sintetica 6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm Reichelt Chemietechnik GmbH+Co 28460 polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm 
BD Regular Bevel Needles, 30 G Becton Dickinson & Co. Ltd. 305106 30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer Vetland Medical Sales and Services LLC -
Artagain drawing paper Strathmore Artist Paper 446-8 coal black
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G Becton Dickinson and Company 305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene Sigma Aldrich GmbH 7987456F TNCB
MMPSense 680 Perkin Elmer  NEV10126 fluorescent imaging dye
Oditest  Koreplin GmbH C1X018 mechanical measurment
Miglyol 812 SASOL - Oil
 BALB/C, C57BL/6 Charles River Laboratories  - Mice used for experiements
PBS Sigma Aldrich GmbH For dilution of the RA serum 
Pipette (100 µL) Eppendorf  Used for TNCB application 
shaver  Wahl  9962 Animal hair trimmer
Living Image  Perkin Elmer  Imaging software to measure OI

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References

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Immunologie Ausgabe 123 Fluoreszenz-Bildgebung Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) Entzündungen, Rheumatoide Arthritis (RA) Kontaktüberempfindlichkeitsreaktion (CHR)
Nicht-invasiv<em&gt; In vivo</em&gt; Fluoreszenzoptische Bildgebung der entzündlichen MMP-Aktivität unter Verwendung eines aktivierbaren Fluoreszenzbildgebers
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Schwenck, J., Maier, F. C.,… More

Schwenck, J., Maier, F. C., Kneilling, M., Wiehr, S., Fuchs, K. Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent. J. Vis. Exp. (123), e55180, doi:10.3791/55180 (2017).

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