Summary
이 논문은 염증의 두 가지 실험 모델에서 키 매트릭스 메탈의 생체 내 활성을 시각화 기동 광학 이미징 프로브를 사용하여 형광 이미지의 적용을 설명한다.
Abstract
이 논문은 서로 다른 2 가지 마우스 염증 모델 인 류마티스 관절염 (RA)과 접촉 한 생체 내 형광 광학 이미징 (OI) 을 통해 활성화 가능한 형광 프로브에 의한 매트릭스 금속 단백질 분해 효소 (MMP) - 활성을 영상화하는 비 침습적 인 방법을 설명합니다 과민 반응 (CHR) 모델. 근적외선 (NIR) 창 (650 - 950 nm)의 파장을 갖는 빛은 650 nm 이하의 파장에 비해 깊은 조직 침투와 최소한의 신호 흡수를 허용합니다. 형광 OI를 사용하는 주요 이점은 다른 동물 모델에서 저렴하고 빠르고 쉽게 구현할 수 있다는 것입니다.
활성화 가능한 형광성 프로브는 비활성 상태에서는 광학적으로 침묵하지만 프로테아제에 의해 활성화되면 높은 형광성을 갖습니다. 활성화 된 MMP는 조직 파괴를 일으키고 RA 및 CHR과 같은 지연 형 과민 반응 (DTHR)에서 질병 진행에 중요한 역할을합니다. 또한 MMP는연골 및 뼈의 파괴와의 키 프로테아제 - 염증성 사이토 카인에 반응 대 식세포, 섬유 아세포 및 연골 세포에 의해 유발된다. 여기뿐만 아니라 질병의 유도 후 6 일 MMP-2, -3 같은 키 MMP의 활성화되어 프로브, -13 및 -13를 사용하여 근처 RA에서 MMP 활성의 적외선 형광 OI 및 대조군 마우스에 대한 촬상 프로토콜을 기술 급성 (1 배 도전)과 만성 건강한 귀에 비해 오른쪽 손잡이 (5 배 도전) CHR와 마우스에있다.
Introduction
류마티스 성 관절염 (RA)이나 건선의 건선과 같은자가 면역 질환은 지연 형 과민 반응 (DTHR)으로 분류됩니다. 1 RA는 부식성 윤 활막염과 관절 파괴를 특징으로하는 일반적인자가 면역 질환입니다. 염증 세포의 침투와 증식, 염증 세포의 발현 증가로 판 누스 형성, 연골 및 뼈 파괴를 일으키는 염증 관절염 관절. matrix metalloproteinases (MMPs)에 의한 콜라겐과 같은 세포 외 기질 분자의 절단은 조직 전환과 혈관 신생에 필수적이며 조직 파괴를 유발합니다. 5 , 6 접촉 과민 반응 (CHR)은 호중구가 응집되어 산화가 일어난다는 특징이 있습니다. RA와 유사하게 CHR의 MMP는 변이 형이다만성 염증을 설정하기 위해 조직 변환, 세포의 이동과 혈관 신생에 VED.
RA를 조사하기 위해, 글루코스 -6- 포스페이트 이소 머라 제 (GPI) -serum 주입 마우스 모델을 사용 하였다. GPI에 대한 항체를 포함하는 트랜스 제닉 K / BxN 마우스 8 혈청 류마티스 염증 GPI 혈청 주입 후 6 일째에 부은 발목 최대 24 시간 (1.1 참조)에서 개발하기 시작 후 나이브 BALB / c 마우스에 주입 하였다. 만성 CHR을 분석하기 위해, C57BL / 6 마우스는 복부에 trinitrochlorobenzene (TNCB)에 민감했다. 오른쪽 귀는 감작 후 일주를 시작하기 5 회까지 도전되었다 (도 1.1 및 1.2 참조).
비침 작은 동물 OI 주로 임상 연구에서 사용되어, 직관 형 형광등 chemiluminescent- 및 생물 발광-신호의 생체 내 연구에 기초한 기술이다. 취득한 반 정량적 데이터는 molec에 대한 통찰력을 제공합니다울라 기관의 메커니즘과 건강의 조직뿐만 아니라 병에 걸린 실험 동물 모델 및 측정을 따라 길이 방향의 수 (예를 들어 생체 내에서 치료 반응 프로파일을 평가하기 위해). 같은 동물이 아닌 시점에 따라 다른 마우스를 사용하는 여러 시점에서 후속 연구에서 측정 할 수있는 종 연구의 큰 장점은 동물 수의 감소이다. OI의 해상도는 기관의 상세한 기능 이미징 및 실험 동물에서 더 작은 조직 구조를 할 수 있습니다.
-70 ° C까지 많은 장치에서 냉각되어 좁은 투과 스펙트럼, A A 차광판에 의해 산란 빛으로부터 보호 "어두운 박스"및 대전 성 결합 소자 (CCD) 카메라와 특정한 여기 및 방사 필터를 사용 매우 특정한 수 있고 형광 신호 민감한 측정.
excitation-과 함께 형광 제를 사용하여근적외선 형광 창 (650 - 950 nm)의 방출 스펙트럼에서 신호 대 잡음비가 크게 향상 될 수 있습니다. 근적외선 형광 창은 헤모글로빈과 물에 의한 신호 흡수가 상대적으로 낮을뿐만 아니라 배경 자동 자기장이 낮다는 특징이 있습니다. 9 이것은 작은 동물의 조직에서 2cm까지 침투 깊이를 허용합니다. OI- 프로브는 표적 조직을 직접 ( 예 : 형광 표지 된 항체에 의해) 처리하거나 표적 조직에서 활성화시킬 수 있습니다 ( 예 : 프로테아제). 활성화 가능한 OI 프로브는 Förster 공명 에너지 전달 (FRET)으로 인해 비활성화 된 형태로 광학적으로 침묵하며, 이는 분자 내의 여기 에너지를 다른 영역으로 이동시키는 퀀칭 부분 (quenching moiety)으로 향하게됩니다. 염료가 (예를 들어 프로테아제에 의해) 절단되면, 에너지는 더 이상 분자 내에서 전달되지 않으며, 형광 신호는 OI에 의해 검출 될 수있다. 이것은 높은 특이성을 갖는 OI 프로브의 설계를 허용합니다뚜렷한 생물학적 과정과 탁월한 신호 대 잡음비.
다음 프로토콜은 동물의 준비, 생체 내에서 MMP-2, -3, -9 및 -13 활성 및 염증의 두 실험 모델 (RA, CHR)을 이미지화하기 위해 Activatable OI 프로브를 사용하여 OI 측정을 자세히 설명합니다.
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Protocol
이 문서에 설명 된 모든 절차는 지침과 관리 및 실험 동물의 사용의 국제 표준을 따라 국가위원회 튀빙겐, 독일의 지역 동물 복지와 윤리위원회에 의해 승인되었다. 12 시간 광 : - 8 ~ 12 주령 BALB / C 및 C57BL / 6 마우스는 12 시간에 보관 하였다 암주기를 2 그룹으로 22 ± 1 ℃에서 IVCs 표준화 된 환경 조건에 수납 된 - 물 (5) 음식 액세스 수의.
1. 재료 준비
- 사출 직전 각 데이터 시트에 따른 근 적외 형광 영상을위한 OI 염료 희석. 생체 내에서 MMP의 측정을 기동 OI 염료 (680 nm에서 여기 상업용 프로브)를 1.5 ml의 PBS 1X 20 nmol의 농도로 사용할 수 있습니다. 부드럽게 흔들거나 사용하기 전에 솔루션을 소용돌이. 빛으로부터 보호 할 때 최대 6 개월 동안 11 °의 C - OI 염료 2에 저장 될 수있다. 정맥 내 (IV) 주사는 정맥 카테터를 준비한다. 20 U (50 ㎖ 헤파린 10 개 분사 유니트를 포함)는 0.9 % 식염수 용액으로 채워진 (0.5 mL) 중 인슐린 주사기 및 폴리에틸렌 카테터에 부착 된 30 게이지 바늘을 사용한다. OI가 염료의 마우스 당 2 nmol의 권장 복용량을 주입한다.
류마티스 관절염 및 만성 연락 과민 반응 2. 유도
- 류마티스 관절염:
- RA를 유도하는 1X PBS (200 μL)를 1 (K / BxN 마우스 (10)로부터 얻은) 혈중 글루코스 -6- 포스페이트 이소 머라 제 (GPI)에 대해 1 함유 항체 (AB)의 100 μL 희석. -80 ° C에서 희석 된 혈청을 저장합니다. RA의 유도에 대한 상세 절차는 Monach 동부 등에 의해 설명된다. 8.
- RA를 유도하기 위해 꼬리에 의해 부드럽게 각 마우스를 올려 t의 일 0에 희석 된 혈청 복강 내 (IP)의 200 μL를 주입그는 실험했다. 주입 후 마우스를 직접 케이지에 넣으십시오.
- 선택적으로, AB 주입 전에 각 발목의 발목 직경을 측정하고 "관절염 점수"( 그림 1A )를 정의하십시오. 기계적 측정 장치 (마이크로 미터)를 사용하여 GPI- 혈청 후 6 일째까지 매일 발목 부종을 측정하십시오.
- RA 생쥐의 꼬리 정맥 에 생체 내 MMP 활성을 측정하기 위해 활성화 가능한 OI 염료 (단계 1.1 - 1.2)를 주사 GPI- 혈청 주사 후 5 일째 및 대조군 마우스의 꼬리 정맥 내로 투여 하였다. 꼬리 정맥 주사 후 24 시간 동안 광학 이미징 실험을 수행하십시오.
- 과민 반응에 연락하십시오 :
- C57BL / 6 생쥐의 sensitization 들어, 아세톤 / 오일의 4 : 1 혼합물에 용해 5 % TNCB 솔루션을 준비합니다.
- 100 % 산소 (1.5 L / 분)로 증발 된 1.5 % 이소 플루 란을 사용하여 C57BL / 6 마우스를 마취시킨다. 마우스가 anesthetized되면, 자기 미친에 넣어 e 코 콘 (1.5 vol % 이소 플루 란 관에 연결된 5 ml 폴리에틸렌 주사기를 자르십시오)을 마취 유지하십시오. Anesthetized 동안 마른 동물의 눈 건조를 방지하기 위해 수의사 용 연고를 바르십시오.
- 작은 동물 머리 트리머를 사용하여 배를 조심스럽게 (2 x 2 cm) 면도하십시오. 동물의 비특이적 인 형광 신호를 유발할 수 있고 연구 결과에 영향을 줄 수 있으므로 피부 손상을 피하십시오.
- 동물을 sensitizing 100 μL 피펫을 사용하여 면도 복부 영역에서 천천히 5 % TNCB 솔루션의 80 μL를 적용합니다. 각막 손상을 방지하고 회복기 동안 낮은 체온을 피하기 위해 마우스의 눈이 침구와 닿지 않도록주의하면서 새장에 부드럽게 다시 놓습니다.
- 민감화 6 일 후에 1 % TNCB 용액 (아세톤 / 오일의 9 : 1 혼합물에 용해)을 준비하고 급성 및 만성 CHSR을 유도하기 위해 피펫을 사용하여 오른쪽 귀에 20 μL를 적용합니다."> 1
- 100 μL 피펫을 사용하여 1 % TNCB 솔루션의 20 μL와 오른쪽 귀 양쪽에 1 차 도전 과제로 시작하고 CHR ( 그림 1B )를 이끌어 내기 위해 매 5 일 (감작 후 15 일) . 마이크로 미터 측정 장치를 사용하여 매일 귀 두께를 측정하십시오.
- 챌린지 12 시간 후 CHR 마우스의 생체 내 에서 MMP 활성을 측정하기 위해 활성화 가능한 OI 염료 (680 nm에서 여기가있는 상용 프로브)를 주입합니다 (1.1-1.2 단계). 꼬리 정맥 주사 24 시간 후 광학 이미징 실험을 수행하십시오 ( iv ).
3. 광학 이미징을위한 동물 준비
- 사용 된 OI 요원의 형광 신호와 자동 형광 (약 700 nm)의 간섭을 피하기 위해 낮은 또는 비 형광 chow ( 예 : 망간 무료)에 마우스 chow (적어도 이미징하기 전에 3) 스위치.
- 동물을에 넣으십시오.(1.5 L / 분) (산소는 공기로 대체 될 수 있지만 하나의 실험 내에서 표준화 될 필요가 있음)로 증발 된 1.5 부피 %의 이소 플루 란을 사용하여 마취시킨다.
- 마우스가 눈으로 마취되면, 자기 - 만든 코 콘 (1.5 vol % isoflurane 튜브에 연결된 절단 5 ML 폴리에틸렌 주사기에 의해 빌드)에 배치하고 마취를 유지합니다.
- 작은 동물 머리 트리머를 사용하여 대상 부위 (2 cm x 2 cm)에 동물을 면도하십시오. 동물의 비특이적 인 형광 신호를 유발할 수 있고 연구 결과에 영향을 줄 수 있으므로 피부 손상을 피하십시오.
참고 : Hairs는 관심 부위 (ROI)에 따라 OI (마우스 스트레인에 따라 다르지만 흡수가 많거나 적음) 동안 형광 신호를 흡수 할 수 있습니다. - iv 주사의 경우, 따뜻한 물에 마우스의 꼬리를 두어 혈관 확장을 유도하고 주사 부위의 피부를 알코올로 부드럽게 씻고 카테터를꼬리의 말초 사이트. (가) 꼬리 정맥에 20 °의 각도에있는 바늘의 끝을 "잘라"주사기를 다시 현탁 카테터의 정확한 배치를 테스트 놓는다.
- 카테터가 올바르게 위치되면, 주사기를 교체하고 OI 프로브 (2 nmol의)을 분사. 주입 후 주사기를 교체하고 0.9 % 생리 식염수 폴리에틸렌 관의 완전히 명확 죽은 볼륨의 25 μL를 주입.
주 : 사용 OI 염료의 조직 반감기 시간 생체 MMP 활성을 측정 (680 nm에서 여기와 상용 프로브)는 72 시간이다. 완전한 통관을 보장하기 위해, 염료의 재 주입은 이전에 주입 한 후 이전 칠일 이상 사용하지 않는 것이 좋습니다.
4. 광학 이미징
- 시야 (FOV)의 중심에 OI 스캐너의 블랙 박스 검은 플라스틱 또는 종이 시트를 배치했다.
- 측정 프로토콜을 설정하고 적절한 파장을 선택합니다 (여기 : 680 ± 10 nm의 전자임무 : 700 ± 10 nm) 및 영상 매개 변수.
참고 : 일부 OI 시스템에서는 몇 가지 이미징 염료에 대한 설정이 미리 정의되어 있습니다. - 형광 이미징을위한 올바른 프로토콜을 선택하려면 이미징 소프트웨어 (제조업체가 제공함)를 열고 시스템을 초기화하십시오. 대부분의 CCD 카메라는 작동 온도까지 냉각해야하며 10 분 정도 걸릴 수 있습니다. 안정적인 결과를 얻으려면 시스템이 준비 될 때까지 기다리십시오.
- 생체 내 이미징 시스템 수집 컨트롤 패널 팝업을 관찰하면 선택한 각 필터 쌍이 시퀀스의 한 이미지를 나타냅니다. 이 경우 각각 680 ± 10 nm 및 700 ± 10 nm의 여기 및 방출 파장을 가진 상업용 염료에 대한 필터 쌍으로 하나의 이미지를 수집하고 측정을 시작하십시오 ( "Acquire sequence"). 자세한 내용은 제조업체 설명서를 참조하십시오.
- 이미지에 적절하게 라벨을 지정하고 "이미지 편집"획득 순서 "레이블"는 다음 나타납니다 창 ".
- OI가 염료를 주입하기 전에, 각 동물의 기준 검사를 취하거나, 배경 신호를 구별하기 나이브 대조군을 사용한다.
- OI가 염료의 꼬리 정맥 주사 후 시간은 OI 시스템에서 가장 높은 신호를 측정 할 수있는 위치에서, FOV의 중심에 동물을 배치하고, 측정을 시작한다.
참고 : 중요 : 저체온증 크게 이미징 에이전트의 분포에 영향을 미칠 수있다. 무대는 동물의 저체온증을 방지하기 위해 37 ° C까지 가열되어 있는지 확인합니다. 영상은 1 내지 5 개의 마우스의 동물 군에서 동시에 수행 될 수있다. 동시에 측정하는 동물의 수에 따라 FOV의 크기를 선택합니다. 각 마우스의 표시 여부를 확인하기 위해 밝은 필드 이미지를 취할 수 있습니다.
5. 데이터 분석
참고 : 다음 이미지 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행제조업체의 프로토콜.
- RA의 측정을 위해서는 그림 2 와 같이 보정 된 광자 방출 단위를 사용하는 반면, 만성 CHSR은 신호 세기 (%)로 묘사됩니다.
- ROI를 수동으로 그리려면 툴 플레이트를 사용하십시오. RA 이미지의 분석을 위해 각 동물의 모든 발목과 발에서 가장 높은 신호 주위에 배치 된 표준화 된 원을 사용하십시오. CHSR을 분석하려면 밝은 영역 이미지에 따라 ROI를 전체 오른쪽 귀와 왼쪽 귀 주위에 배치하십시오.
- 특정 그린 ROI에서 광자 방출 또는 신호 강도 값을 측정하려면 "측정"을 누릅니다. 이 시스템은 설명적인 통계 분석을 위해 그려진 ROI에 값을 제공합니다.
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Representative Results
경구 용 BALB / c 마우스에서 류마티스 성 관절염 (RA)을 유도하기 위해, 동물에게 0 일째에 GPI에 대한자가 항체 (1x PBS로 1 : 1로 희석)를 주사 하였다.이 GPI- 혈청에서 최대 염증 (발목 부종) RA 모델은 주사 후 6 일째 날 11에 있다. 따라서, 2 nmol의 활성화 가능한 OI 염료가 준비되었고 5 일째에 관절염 마우스 및 건강한 대조 동물의 꼬리 정맥에 주사되었다. 주사 후 24 시간 (6 일), 마우스를 마취시키고 섹션 3 도 1a ).
CHR을 유도하기 위해, C57BL / 6 마우스를 면도 한 복부에서 0 일째에 5 % TNCB로 감작시켰다. 감작 7 일째에 1 % TNCB를 사용하여 오른쪽 귀에 1 차 시험을 시작했습니다. 만성 염증을 유도하기 위해 최대 5 번의 도전 (15 일)이 수행되었습니다. 7 12 시간 후즉 마지막 도전은 OI 염료 20 nmol의 정맥 내 주사 하였다. (도 1b) 전술 한 바와 같이 15 일, 24 시간 포스트 분사에서 OI가 수행되었다.
그림 2 발목 (도 2A)를 제어하는 비교 뒷발, 발목 질환 유도 후 6 일째에 마우스 RA의 앞발에서 명백히 향상된 형광 신호. RA 생쥐의 기관 및 건강한 마우스에서 MMP 활성의 생체 분포 분석은 뒷발, 발목 강하게 향상된 시그널을 나타내 RA 및 마우스의 관절에서 독점적으로 발을 이물. 건강한 대조군 마우스 (우측도 2a)의 신장에 비해 흥미롭게도, 우리는 모든 측정 RA 마우스 모두 신장 인핸스 MMP 신호를 결정 하였다. 또한, 우리는 관계없이 마우스는 RA로 고통 여부의 간 부위에서 강화 된 MMP 신호를 측정 하였다. RA와 건강한 쥐 사이의 차이는 t에서 찾을 수 없습니다그는 췌장, 폐, 비장 및 심장.
만성 CHR (오른쪽 귀에 5 회의 TNCB 도전) 동안, 우리는 건강한 왼쪽 컨트롤 귀 ( 그림 2B )에 비해 오른쪽 염증이있는 귀에 매우 높은 증가 MMP 활동을 측정했습니다.
따라서 우리의 데이터는 염증성 질환 모델 모두에서 질병 진행 중 MMP 활동의 주요 역할을 나타내는 것입니다.
Bioluminescence 및 Fluorescence 용 도구 세트는 예를 들어 형광 색소의 pmol 또는 형광을 나타내는 세포의 수를 정량화합니다. Counts : 카메라에 입사 한 광자에 대한 보정되지 않은 측정 값을 표시합니다. 2. Radiance (광자) : "광자 / 초 / cm 2 / 스테 라디안"으로 광자 방출의 보정 된 측정 값을 나타냅니다. 루미넌스 이미징 또는 3. Radiant Efficiency (형광) : 형광 측정에 대해 권장되는 입사 구동 전력 당 형광 방출 광도를 보여줍니다.
OI 이미지를 분석하면서 빛의 단위로 작업하는 것의 큰 장점은 한 번의 실험에서 카메라 설정을 변경할 수 있다는 것입니다. 이는 이미지 자체 또는 측정 된 ROI 데이터에 영향을 미치지 않으므로 다른 IVIS 시스템의 이미지를 비교할 수 있습니다.
관심 영역 (ROI)은 광학 이미지에서 사용자가 관심을 갖는 특정 영역을 나타냅니다. 도구 모음을 사용하면 측정 (이미지의 ROI에서 신호 강도 측정), 평균 배경 (배경에 대해 사용자 정의 영역의 평균 신호 강도 측정) 또는 제목 ROI (대상 동물 식별 이미지).
주제가 불만 인 경우높은 배경 자체 비특이적 신호가 재생 대상 ROI로부터 백그라운드 신호 (ROI)을 빼서 백그라운드 보정 된 ROI 측정을 얻었다. 자동 형광을 결정하기 위해 가까운 제로로 이미지 최소 설정하거나 자연스럽게 이미지의 배경 발광을 발생. 측정 된 특정 이미지에 주로 측정 자체 정의 (이용자 특정) 배경 이미지 (ROI)에 영상 링크.
이미지의 반 정량 분석은 생활 이미지 소프트웨어를 사용하여 관절염과 발목을 제어 할뿐만 아니라에 염증이 건강한 양쪽 귀에 관심 (로아)의 표준화 된 지역을 그리기에 의해 수행되었다. 단지 기술적 통계 분석 인해 동물의 수가 충분 방법이 원고에 생체 데이터에 대해 수행 하였다. 관절염과 발목 또는 발 건강의 신호 강도를 분석 발목 대조군에 비해 관절염의 7 배 향상된 MMP 신호 강도를 보였다. 관절염 생쥐의 앞발에서는 건강한 동물과 비교하여 3 배 높은 MMP 신호 강도가 검출되었습니다 ( 그림 3A ).
급성 및 만성 CHR을 가진 귀에 대한 분석에서 왼쪽 도전하지 않은 대조군 귀와 비교하여 1 차 접종 후에도 유의하게 증가 된 MMP 신호를 보였으며, 3 차 접종 후 더욱 증가하였고 5 차 접종까지 동일한 수준을 유지했다 ( 그림 3B ) . 마우스의 긁힘으로 인해 왼쪽 귀의 접촉 알레르겐이 오염 된 결과, 왼쪽 (TNCB가 아닌) 컨트롤 귀에서 약간 증가 된 MMP 신호가 결정되었습니다. 이 결과는 OI로 측정 한 GPI- 관절염 및 만성 염증시 형광 신호의 증가로 인해 MMP의 중요한 역할을 나타냅니다.
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그림 1 : RA 및 CHR 모델, OI시기의 질병 유발 및 시간 경과 (A) BALB / C 마우스 (B) 에서의 RA 유도 시간 및 C57BL / 6 마우스에서의 만성 CHR 유도. 두 모델 모두에서 MMP 활성을 측정하기위한 OI 염료의 각 생체 내 이미징 시점 및 관련 주입 시점 개요. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : RA, CHR 및 Control Animals의 MMP OI. (A) GPI - 관절염 유도 6 일 후 관절염 마우스 및 건강한 컨트롤 마우스 (왼쪽)에서 측정 된 MMP 활성의 대표 결과. 현저하게 높은 신호 (Radiance (p / s / cm 2 / sr)) int건강한 마우스와 비교하여 관절염에서 정성이 관찰되었다. 오른쪽 이미지는 OI 염색 주사 후 희생 된 GPI 관절염 마우스의 발 뒤꿈치에서 MMP 활동을 표시하며 발목, 앞발, 췌장, 폐, 비장, 심장, 신장, 간 및 장을 포함합니다. 마우스가 GPI 혈청 (RA 마우스) 또는 대조군 혈청 (건강한 대조 마우스)을 주사했는지 여부에 관계없이, RA 생쥐와 간장의 앞발, 발목 및 뒷발에서 높은 신호를 나타냈다. 만성 CHR (좌측) 및 대조 동물 (우측)을 갖는 귀에있어서의 (B) MMP 형광 신호. 염증이 있었던 오른쪽 귀 (5 번 시도)는 대조 귀와 비교하여 매우 향상된 신호를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
<br /> 그림 3 : OI를 사용하여 염증 및 건강한 발목 및 귀 조직의 반 정량 분석. (A) 앞발과 발목 관절에서 RA와 건강한 동물의 형광 신호의 반 정량 분석. 관절염 앞발과 발목 관절은 건강한 발목 관절과 앞발에 비해 유의하게 (** p <0.05) (n = 3) 높은 MMP 신호를 나타냅니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. (B) 1 차 , 3 차 및 5 차 챌린지 후 왼쪽 및 오른쪽 (도전) 귀의 반 정량 분석. MMP 신호는 1 차 챌린지에서 5 차 챌린지 까지 크게 증가했으며 3 차 챌린지 (3 p) (n = 3) 이후에 오른쪽 챌린지 드 이드에서 이미 최대 신호 강도를 보였습니다 (컨트롤 귀는 부분적으로 TNCB 이것은 쥐가 긁기 때문입니다. 이것은 의미가없는 신호를 증가 시켰습니다). 데이터는 평균값으로 표시됩니다.± SEM. 양쪽 모델에 대한 염증 (GPI 관절염 발목, 오른쪽 치료 귀)과 대조군 (대조 발목, 치료되지 않은 귀 둘 다)의 차이를 분석하기 위해 양측 학생 t- 테스트를 사용했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
OI는 전임상 연구 에서 비 침습적 생체 내 분자 이미징을위한 매우 유용하고 빠르며 저렴한 도구입니다. OI의 특별한 강점은 염증 반응과 같은 매우 역동적 인 과정을 모니터하는 능력입니다. 또한 OI는 수 일에서 수주에 이르는 장기간의 질병 경과를 추적 할 수있게 해줍니다.
OI는 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 또는 자기 공명 영상 (MRI)과 같은 다른 생체 내 이미징 방식보다 몇 가지 장점이 있습니다. 이는 시간과 비용이 매우 효율적이기 때문입니다. 획득 당 최대 5 마리의 동물을 이용한 높은 처리량 분석이 가능합니다. 또한, 많은 다른 생물학적 과정을 목표로하는 많은 수의 프로브가 이용 가능하다. 추가 해부학 정보를 제공하기 위해 OI는 MRI 또는 X 선과 같은 다른 이미징 기술과 결합 될 수 있습니다. 또 다른 한계는 낮은 조직 침투 깊이가 예 를 들어 functional PET 이미징. 또한 많은 다른 생물학적 표적을 겨냥한 많은 양의 프로브가 이용 가능합니다. 12
마취의 효과는 생체 내 이미징에서 과소 평가해서는 안됩니다. OI 결과에 대한 마취의 구체적인 효과는 잘 설명되어 있지 않지만, 우리 그룹은 PET 이미징 결과에 대한 마취의 영향을 여러 연구에 나타 냈습니다. 13 , 14 , 15 예를 들어, Fuchs et al. 다른 호흡 및 마취 프로토콜을 사용하여 PET 스캔 전후의 pCO 2 , pH 및 젖산과 같은 혈액 변수를 분석했습니다. 의식이있는 산소 또는 공기 호흡 마우스에 비해 마취 된 pCO 2 및 젖산 농도의 유의 한 변화가 PET 결과의 유의 한 변화를 유도한다는 것이 밝혀졌습니다. 그들은이 효과가 주로 산소 호흡과 subsequen에 의한 것이라고 결론을 내린다.동물에서 호흡 성 산증을 유발하여 PET 영상에서 다른 결과를 초래합니다.
O 2 농도 및 마취제 투여와 같은 마취 매개 변수의 표준화 및 저체온증의 예방은 체계적인 실패를 방지하는 데 도움이됩니다. 물론 OI는 물리적 특성, 예를 들어 광산란, 조직 자동 형광 및 광 감쇄에 의해 제한됩니다. OI의 거시적 결과와 생체 내 형광 현미경 검사 또는 유동 세포 계측법과 같은 다른 기술을 결합하여 여러 그룹이 이러한 문제를 해결합니다.
MMP- 특이 적 활성화 가능한 형광 프로브에 의한 MMP 활성의 생체 내 이미징은 CHS와 같은 염증의 여러 실험 모델뿐만 아니라 뇌 허혈, 16 대동맥 동맥류, 17 심근 경색과 같은 질병에서도 사용되어왔다및 동맥 경화성 플라크 (19)뿐만 아니라 다양한 종양 모델. (20)
예를 들어, 코르-Retamozo 등. 24 시간 이전에 알부민 감작 마우스의 비강 내 적용 후 MMP 활성화 가능한 탐침을 주사하여 알레르기기도 염증 모델에서의 MMP의 생체 내 활성을 연구 하였다. 21 자세히 질환과 치료 반응의 과정을 모니터하기 위해 MMP 활동 더이 그룹 결합 단층 OI, NIR 광섬유 기관지 내시경 및 생체 내에 현미경의 위치를 확인합니다. (21)
다른 접근 방법은 생체 내 MMP 활동이 대부분 MMPs에의 활성 부위에 결합 MMP 억제제를 사용하여 측정합니다. 매킨타이어는 등. 생체 내 종양은 "proteolyt 역할을"고분자 계 형광 기판 "을 사용하여 검출-MMP-7 연관된 기술 된ic beacon "을 이용하여 마우스 이종 이식 모델에서 MMP-7의 활성을 선택적으로 검출 할 수 있음을 보여 주었다 .23 또한 Olson 등은 "활성화 성 세포 침투 펩타이드 "(ACPPs)를 연구하여 많은 이종 이식 종양 모델을 표적으로하지만, 링커가 단백질 분해 될 때까지 세포 내로 흡착 할 수 없다 .MMP-2 및 MMP-9에 대해 선택적 인 ACPP를 조사한다.
단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT) 또는 PET 이미징을위한 방사성 동위 원소로 MMP 억제제를 라벨링하여 죽상 동맥 경화증 26 및 암 27 에서의 MMP 발현을 연구했습니다. 최근 연구에서 형광 표지 된 MMP 억제제를 MMP 활성 가능 탐침과 비교했습니다. 형광 표지 된 MMP 억제제는 소음에 대한 신호가 더 낮았다비율로 활성화되지만보다 짧은 섭취 시간이 필요했습니다.
병리 생리학의 주요 특징을 평가하기위한 새로운 바이오 마커는 OI에 의해 활용되고 검증 될 수있다. 예를 들어, 위험 관련 분자 패턴 (DAMPs)에 대한 반응은 염증 반응 동안의 초기 사건이다. Vogl et al. 급성 귀 피부 피부염, 콜라겐 유발 성 관절염 및 주요한 Leishmania 감염 모델에서 염증의 조기 징후에 대한 민감한 생체 표지자를 개발하기 위해 alarmin S100A9에 대한 Cy5.5 표지 항체를 사용했다. 29
결론적으로, OI 는 생체 내 에서 질병의 새로운 메커니즘을 규명 하고 , 새로운 분자 표적을 특성화하며, 치료 효과를 모니터링 할 수있는 전임상 연구를위한 빠르고 효율적인 방법을 제시 합니다. 그럼에도 불구하고 PET와 같은보다 정량적 인 기법을 사용한 후속 검증 프로세스가 필요할 수 있습니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
탁월한 기술 지원에 대해 Daniel Bukala, Natalie Altmeyer 및 Funda Cay에게 감사드립니다. 원고를 편집 한 Jonathan Cotton, Greg Bowden 및 Paul Soubiran에게 감사드립니다. 이 작업은 Werner Siemens-Foundation과 Eberhard Karls University Tübingen의 의학 교수 ( "Promotionskolleg") 및 CRC 156 (프로젝트 C3)을 통한 DFG의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
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