Dette dokumentet beskriver anvendelse av fluoriserende billeddannelse ved bruk av en aktiverbar optisk avbildning sonde for å visualisere den in vivo aktivitet av sentrale matriksmetalloproteinaser i to forskjellige forsøksmodeller for inflammasjon.
Dette dokumentet beskriver en ikke-invasiv metode for avbilding matriks-metalloproteinaser (MMP)-aktivitet ved en aktiverbar fluorescerende probe, via in vivo fluorescens optisk imaging (OI), i to forskjellige musemodeller for inflammasjon: en revmatoid artritt (RA) og et kontakt hypersensitivitetsreaksjon (CHR) modell. Lys med en bølgelengde i det nær-infrarøde (NIR) vindu (650-950 nm) tillater en dypere penetrering vev og minimale signalopptaket sammenlignet med bølgelengder under 650 nm. De største fordelene ved bruk av fluorescens OI er at det er billig, rask og enkel å implementere i ulike dyremodeller.
Aktiverbare fluorescerende prober er optisk stille i deres inaktiverte tilstander, men blir sterkt fluoriserende når den aktiveres av en protease. Aktiverte MMP'er føre til vevsdestruksjon og spiller en viktig rolle for sykdomsprogresjon i forsinket type hypersensitivitetsreaksjoner (DTHRs) slik som RA og CHR. Videre MMP ernøkkel proteaser til brusk og ben nedbrytning og blir indusert av makrofager, fibroblaster og kondrocytter som respons på proinflammatoriske cytokiner. Her benyttes en sonde som er aktivert ved nøkkel MMPs som MMP-2, -3, -9 og -13 og beskrive en avbildningsprotokoll for nær infrarød fluorescens OI av MMP-aktivitet i RA og kontrollmusene 6 dager etter sykdomsinduksjon i tillegg som i mus med akutt (1x utfordring) og kronisk (5x utfordring) CHR til høyre øre sammenlignet med friske ører.
Autoimmune sykdommer som reumatoid artritt (RA) eller psoriasis vulgaris er gradert som forsinket-type overfølsomhetsreaksjoner (DTHR). 1 RA er en vanlig autoimmun sykdom kjennetegnet ved erosiv synovitt og felles ødeleggelse. 2 Inflammerte leddforbindelser viser infiltrering og spredning av inflammatoriske celler, et økt uttrykk for proinflammatoriske celler som fører til dannelse av pannus, brusk og beinforstyrrelser. 3 , 4 Spaltningen av ekstracellulære matriksmolekyler, slik som kollagen ved matriksmetalloproteinaser (MMPs), er essensielt for vevsomdannelse og angiogenese og forårsaker vevsdeplosjoner. 5 , 6 Kontakt overfølsomhetsreaksjoner (CHR) er karakterisert ved aggregering av nøytrofiler som fører til en oksidativ utbrudd. 7 I likhet med RA er MMPs i CHR involvertVed ved vevskonvertering, celle-migrasjon og angiogenese for å etablere kronisk betennelse.
For å undersøke RA ble glukose-6-fosfat-isomerasen (GPI) -seruminjeksjonsmusemodellen brukt. 8 Serum fra transgene K / BxN-mus inneholdende antistoffer mot GPI ble injisert i naive BALB / c-mus, hvorpå revmatisk betennelse begynte å utvikle seg innen 24 timer med maksimal ankelutvikling på dag 6 etter GPI-seruminjeksjon (se 1.1). For å analysere kronisk CHR ble C57BL / 6-musene sensibilisert med trinitroklorbenzen (TNCB) på magen. Høyre øret ble utfordret opptil 5 ganger med 1 uke etter sensibilisering (se også 1.1 og 1.2).
Ikke-invasivt lite dyr OI er en teknikk basert på in vivo- undersøkelsen av fluorescerende, kjemiluminescerende og bioluminescerende signaler, som hovedsakelig brukes i preklinisk forskning. De tilegnede semikvantitative dataene gir innsikt i molekyletUlar mekanismer i organer og vev av friske og syke eksperimentelle dyremodeller, og muliggjør langsgående oppfølgingsmålinger (for eksempel å vurdere terapeutiske responsprofiler in vivo ). En stor fordel ved longitudinale studier er reduksjon av dyrenummer, da de samme dyrene kan måles i oppfølgingsstudier på flere tidspunkter i stedet for å bruke forskjellige mus per tidspunkt. Oppløsningen av OI tillater detaljert funksjonell avbildning av organer og enda mindre vevstrukturer i eksperimentelle dyr.
Bruken av spesifikke eksitasjons- og utslippsfiltre med et smalt transmisjonsspekter, beskyttelse mot spredt lys av en lettisolert "mørk boks" og et følsomt ladet koblet enhet (CCD) kamera som avkjøles i mange enheter ned til -70 ° C , Tillater svært spesifikke og følsomme målinger av fluorescenssignaler.
Ved å bruke fluorescerende midler med eksitasjon ogemisjons-spektra i det nær-infrarøde fluorescens vindu (650-950 nm), kan signal-til-støyforholdene forbedres betraktelig. Den nær-infrarøde fluorescens vindu kjennetegnes ved en forholdsvis lav absorpsjon av signalet ved hemoglobin og vann, samt en lav bakgrunn auto-fluorescens. 9. Dette gir en inntrengningsdybde på inntil 2 cm i vevet av små dyr. Oi-prober kan adressere et mål direkte (for eksempel ved en fluorescens-merket antistoff) eller kan aktiveres i målvevet (for eksempel ved proteaser). Aktiverbare OI prober er optisk stille i deres inaktiverte skjema på grunn av den Förster resonans energioverføring (FRET) til en bråkjøling del, som overfører eksitasjonsenergi i molekylet til et annet domene. Dersom fargestoffet er spaltet (ved hjelp av en protease for eksempel) blir energien ikke lenger overføres i molekylet og et fluorescerende signal som kan påvises ved OI. Dette tillater konstruksjon av OI prober med høy specificity for forskjellige biologiske prosesser og gode signal-til-støy-forhold.
Følgende protokoll beskriver i detalj fremstillingen av dyrene, OI målingene med et Activatable OI sonde til bilde MMP-2, -3, -9 og -13 aktivitet in vivo og to forsøksmodeller for inflammasjon (RA, CHR).
OI er en meget nyttig, rask og billig verktøy for ikke-inntrengende in vivo molekylær avbildning i prekliniske undersøkelser. En særlig styrke OI er evnen til å overvåke sterkt dynamiske prosesser som inflammatoriske responser. Videre tillater OI man for å følge forløpet av en sykdom i en lengre periode, som strekker seg fra dager til uker.
OI har flere fordeler fremfor andre in vivo avbildningsmetoder, slik som positron-emisjonstomografi (PET) eller magnetisk reso…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Daniel Bukala, Natalie Altmeyer og Funda Cay for utmerket teknisk støtte. Vi takker Jonathan Cotton, Greg Bowden og Paul Soubiran for redigering av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Werner Siemens-stiftelsen og Medisinsk fakultet for Eberhard Karls Universitet Tübingen ("Promotionskolleg") og av DFG gjennom CRC 156 (prosjekt C3).
Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
Heparin | Sintetica | 6093089 | |
High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |