Summary
Субретинальное инъекции широко применяется в доклинических исследованиях стволовых клеток заместительной терапии для age-related macular вырождения. В этой статье визуализировать мы описываем техника менее рискованным, воспроизводимые и именно изменение субретинальное инъекции через транс склеры подход к доставить клетки крыс глаза.
Abstract
Дегенеративные заболевания сетчатки, например возрастной макулярной дегенерации (AMD) являются основной причиной потери необратимых зрения во всем мире. AMD характеризуется дегенерации сетчатки пигментного эпителия (ПЭС) клеток, которые являются монослоя клеток функционально поддержки и анатомически обтекание нейронных сетчатки. Текущий фармакологических препаратов для не неоваскулярной AMD (сухой AMD) только замедлить прогрессирование болезни, но не может восстановить зрение, требующих исследования, направленные на выявление новых терапевтических стратегий. Замена дегенеративных клеток ПЭС с обещанием держит здоровые клетки для лечения сухой AMD в будущем. Обширные доклинические исследования терапии стволовой клетки для AMD включать трансплантация стволовых клеток НПП клеток в пространство субретинальное животных моделей, в которых применяется техника субретинальное инъекции. Подход, наиболее часто используемых в этих преклинических исследований на животных, через транс склеры маршрут, который затрудняется отсутствием прямого визуализации конца иглы и часто может привести к повреждению сетчатки. Альтернативный подход через стекловидное тело позволяет непосредственное наблюдение за конечное положение иглы, но она сопряжена с высоким риском хирургической травмы как обеспокоены больше тканей глаза. Мы разработали менее рискованным и воспроизводимые модифицированных транс склеры инъекции метод, который использует определенные иглы углах и глубинах успешно и последовательно доставить НПП клетки в пространство субретинальное крыс и избежать чрезмерного повреждения сетчатки. Клетки, доставлен таким образом ранее доказали быть эффективным в Королевском колледже хирургов (RCS) крысы по крайней мере 2 месяца. Этот метод может использоваться не только для трансплантации клеток, но и для доставки небольших молекул или генов терапии.
Introduction
Сетчатки расположен на задней части глаз функции как легкие сенсорные ткани и человека играет решающую роль в восприятии видение. Сетчатки клетки дисфункции или смерть клетки поэтому вызывает проблемы со зрением или причинения постоянной слепоты. Расстройств, связанных с дегенерацией или дисфункции клеток в разных слоях сетчатки известны как дегенеративные заболевания сетчатки, среди которых AMD является наиболее распространенным типом и ведущей причиной необратимой слепоте в пожилых людей в развитых странах 1,2. Патологический процесс AMD связан с накоплением «друз» между слоем ПЭС и мембраны Бруха-основной, который в свою очередь ухудшает НПП поддержку фоторецепторных физиологии, ведущих к нейронных атрофии сетчатки и зрение потери3, 4,5. До сих пор, нет никакого лечения для продвинутых сухие AMD (не неоваскулярной). Появление терапия стволовой клетки как новой парадигмы в регенеративной медицине приносит надежду замены неблагополучных или мертвые клетки НПП стволовых клеток здоровые клетки. Действительно, обширные доклинические исследования пересадки стволовых клеток (например, эмбриональных стволовых клеток человека)-производных НПП клетки в ПЭС дегенеративных Животные модели были выполненных6,7, некоторые из которых достигли Клинические испытания8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Недавно альтернативный источник стволовых клеток-резидентов в слое человека ПЭС, стволовые клетки человека ПЭС (hRPESCs), была выявлена нашей лаборатории и в настоящее время используется в доклинических исследованиях hRPESC производные НПП клеток (hRPESC ПЭС) трансплантации терапии для AMD 10 , 11 , 12 , 13.
Субретинальное инъекций техника применяется в доклинических исследованиях, упомянутые выше, несколько групп, в том числе нашей группы. Существует два общих подхода для субретинальное инъекций в животных: Транс vitreal и транс склеры. Транс vitreal подход имеет то преимущество, хирурга, возможность непосредственно наблюдать за конец иглы он проникает передней глаз, пересекает всю vitreal полости, прилегающей к объективу и проникает сетчатки на спине для глаз, чтобы добраться до subretinal пространство14,,1516. Однако это требует подрыва сетчатки в двух местах (передняя и задняя), несет риск повреждения объектива и может привести к обратным клеток в стекловидное тело при отзыве иглы. В противоположность этому транс склера подход, в принципе, избегает участия сетчатки и стекловидного тела, и обратный поток выходит из глаз. В пигментированных грызунов хирург может первоначально наблюдать проникновения склеры, но после прохождения в пигментированных хориоидея, больше не виден конец иглы. Без прямого наблюдения нарушение сетчатки является общим и может привести к сетчатки диссекции и доставки клеток и/или крови в стекловидное тело. Кроме того потому что изогнутые поверхности глаза, это очень трудно понять, какие иглы углах и глубинах являются наиболее эффективными для транс склеры инъекции.
В этой статье визуализировать мы представляем транс склеры субретинальное инъекционный метод сообщил использования послеоперационные оценки с оптическая когерентная томография (OCT), которая позволяет подробный анализ укола. Наша техника транс склеры инъекции использует определенные места, углов и глубины для инъекций иглами производить очень низкой хирургической травмы и высокой надежностью. Здесь мы конкретно продемонстрировать инъекции клеток hRPESC НПП в пространство субретинальное крыс RCS, доклинические модель человеческих драм. С этим методом инъекций мы успешно и последовательно доставлены hRPESC НПП клетки в субретинальное пространство глаза крыс RCS с очень высокий уровень успеха. Инъекции клеток ранее было установлено, приведет к сохранению RCS фоторецепторов по крайней мере 2 месяца после инъекции13. Эта процедура выполняется под микроскопом рассечения и легко учиться. Он требует двух человек (хирурга и ассистента) для выполнения инъекции и среднее время впрыска для каждого животного составляет менее чем за 5 минут. Определенных углах и глубинах для инъекций иглы позволяют для лабораторий, где OCT недоступна, для достижения успешного субретинальное инъекций. Он обеспечивает высокую воспроизводимость субретинальное доступа и может использоваться не только для трансплантации клеток, но и для доставки и генной терапии наркотиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры с участием животных были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) на государственного университета Нью-Йорка в Олбани.
1. Предварительный впрыск подготовка
-
Приготовление суспензии клеток hRPESC НПП
Примечание: Все следующие шаги выполняются в стерильных культуры ткани капот и требуется знакомство с основными стерилизации.- Изолировать клетки первичной hRPE от человека доноров глаза в возрасте 50-90 годы и культуры клеток в 24-ну плиты12. Криоконсервации клеток на проход 1, оттепель, при необходимости и культуры проход 2 клетки (P2) для 4-5 недель (Рисунок 1A) для инъекций.
- Удаление питательной среды12 и осторожно промыть скважин дважды с 500 мкл предварительно нагревают 1 X Дульбекко фосфат буфер солевой без кальция и магния (1 x DPBS-CMF), добавив 1 X DPBS-CMF в скважины с помощью пипетки 1000 мкл и удаление его с помощью вакуума.
- Добавьте 300 мкл трипсина/DNAse каждой скважины. Инкубации клеток hRPESC НПП в трипсина/DNAse (4 ку DNase на 1 мл 0,25% трипсина ЭДТА) 4 мин при 37 ° C, чтобы разбить ячейки.
- Проверьте клетки под микроскопом, чтобы увидеть, если они имеют округлые. Далее для инкубации клеток в трипсина/DNase для дополнительных 2 мин, если они не округляются еще.
- После того, как клетки округляются, используйте пипетку 1000 мкл нарезанных отдельные клетки из скважины и передачи трипсина/DNase, содержащие отдельные клетки в 15 мл конические с равным объемом подогретым питательной среды, чтобы инактивировать DNase трипсина.
- Промыть скважин с подогретым 1 X DPBS-CMF, нежно закупорить вверх и вниз, особенно вокруг краев колодец; Затем добавьте эти клетки предыдущих Конические трубки.
- Центрифуга Конические трубки на 286 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 1 мл питательной среды.
- Подсчет количества ячеек с помощью Горяева.
- Центрифуга на 286 x g 5 мин при 4 ° C для пеллет клетки.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в стерильных сбалансированный соли раствора (BSS) на 50 000 клеток/мкл (для доставки 50 000 клеток в 1 мкл тома во время субретинальное инъекции).
- Перевести окончательный ячейки подвеска (CS) в пробки microcentrifuge 1,7 мл и держать в ледяной воде смеси до использования инъекций.
-
Подготовка клетки инжектор
- Вставьте стерильную 33-иглы скошенный в шприц для инъекции и винт плотно, чтобы собрать инжектор.
- Очистка инжектора с 100% этанола 5 - 6 раз.
- Очистка инжектора с 70% этанол 5 - 6 раз.
- Очистка инжектора с BSS 5 - 6 раз.
- Марк инжектор иглу с стерильных черный маркер на позиции 600 мкм от кончика иглы под микроскопом рассечения (рис. 1B).
- Поместите форсунку на микроманипулятор для инъекций.
2. субретинальное инъекций
-
Хирургический площадь и животных подготовка
- Вес 4-5 неделя старый RCS крыса (60-100 g) и анестезировать его с помощью системы доставки паров изофлюрановая.
Примечание: Чтобы побудить анестезии держать скорость потока изофлюрановая на 5%. Подтвердите, нажав лапы глубины анестезии, а затем уменьшить скорость потока до 2-3% для поддержания анестезии во время операции. - Место стерильным хирургии драпировки, с грелку под, на сцене рассечения Микроскоп, чтобы создать стерильные хирургические области.
- Передача крыса в области хирургической и крыса в носовой конус, подключенный к системе изофлюрановая для поддержания анестезии.
- Покрывают тело крысы с марлей. Щепотка крыса ног для подтверждения полной анестезии.
- Вес 4-5 неделя старый RCS крыса (60-100 g) и анестезировать его с помощью системы доставки паров изофлюрановая.
-
Транс склеры субретинальное инъекции под микроскопом
- Примените капли глаз смазки на крыса unoperated глаз.
- Расположите крысы на его правой стороне с его левый глаз, сталкивается с потолка для инъекций, ее голову к правой руки хирурга и его обратно к хирургу.
- Обрежьте усы, которые покрывают маленькие ножницы глаз.
- Капать небольшое количество мыть глаз с височной стороны левого глаза и собрать излишки в носовой части с хлопка аппликатор для промывания глаз.
- Разбавить ученика с 1% Тропикамид и 2,5% фенилэфрина (свежеприготовленные из 10% фенилэфрина путем разбавления в стерильного 0,9% физиологического раствора в день хирургии) для экзамена OCT впрыск путем применения одной капли каждого.
- Осторожно потяните кожу вокруг глаз 4 - 6 раз открыть веко, чтобы глаз является слегка proptosed для облегчения доступа к регионам кзади лимба.
- Применить капли глаз мыть и держать глаза влажные.
- Аккуратно нарезанных CS (подготовленных на шаге 1.1.12) и загрузить инжектор с 1.2 мкл CS. Загородный 0.2 мкл используется для компенсации инъекций обратного потока.
Примечание: Основываясь на наших измерениях, о 5000-8000 клетки теряются в обратный инъекции 50 000 клеток/мкл, что составляет около 10-16% ячейка потерь и дополнительную 0.2 мкл CS был введен для компенсации этой потери клеток. - Поместите инжектор, заполнены с CS на микроманипулятор (или иметь держать его помощником) вертикально как НПП клетки, как правило, легко утонуть в суспензии.
- Применить капли 0,5% proparacaine (местные актуальные анестезии) на глаз и удалите избыток с хлопка аппликатор.
Примечание: Этот шаг должен подавлять роговицы рефлекс и предотвратить глаз мигает во время последующих шагов. - Используйте щипцы для захвата конъюнктивы кзади лимба, повернуть глаза нос и поднимите конъюнктивы сделать «палатку».
- Используйте ножницы, чтобы отрезать в верхней части «палатки» сделать небольшое отверстие в конъюнктиве и разоблачить базовой склеры.
- Используйте щипцы для захвата края остальных конъюнктивы поле рядом с лимба и повернуть глаза нос, так что зрачкового оси на угол около 30 градусов по отношению к столешнице (рис. 1 c). Продолжение захвата разницы в конъюнктиве необходима для обеспечения борьбы с силой во время вставки иглы и для поддержания глаз с оптимальным углом.
- Чтобы сделать отверстие для инъекции клеток, положение конца иглы стерильные скошенный 31-калибруйте инсулина на 1200-1500 мкм кзади лимба с открытием кончик вверх.
- Отрегулируйте угол инсулин иглы, так что это 10-15 градусов выше склеры (касательной к мнимой плоскости в месте предполагаемой инъекции). Медленно проникать склера Хориоидея комплекс иглы глубиной около 500 мкм. В пигментированных крыса конец иглы «исчезнет» под пигментированной сосудистое. Для бренда инсулин иглы, используемые здесь расстояние от кончика иглы для скоса — 500 мкм.
- Осторожно снять инсулин иглы (очень небольшой выпот в крови может быть замечен).
- Если отмечается чрезмерное кровотечение, копье глаз может применяться очистить отверстие, в случае необходимости. Продолжающееся кровотечение после того, как копье приложение указывает судно может быть повреждена.
- Руководство НПП клеток загруженных инжектор иглу в направляющее отверстие, с отверстием вниз, и на угол около 10-15 градусов по отношению к поверхности местных склеры.
- Аккуратно вставьте инжектор иглу в пилотной скважины на глубину около 500 мкм для доступа к субретинальное пространства. Там должно быть о 100 мкм разницы между краем знака черное перо и точкой, где игла покрыта пигментированной хориоидеи (Рисунок 1 c и 1 D).
- Попросите помощника Осторожно отпустите поршень шприца инжектор придать соответствующий объем клеток (около 1,2 мкл). Будьте готовы предоставить некоторые борьбе с силой как помощник давит на поршень.
Примечание: Ранее макет практики с помощником может обеспечить как хирурга, так и помощник с необходимым опытом с этим шагом. - Визуально сосредоточиваясь на перо Марк края, провести инжектора в место для 25-30 s и затем медленно втягивать инжектор. Часто наблюдается небольшое количество обратного потока.
Примечание: Если наблюдается не противотока, возможно, были интравитреальные инъекции. Если вы видите обратного потока через печать или клетки, заполнение под склеры, инъекции был слишком мелкой. - Прополоскать измеряем клетки от укола с стерильных глаза мыть 3 раза и собрать излишки с хлопка аппликатор.
- Применить капли глаз смазки на оперированный глаз и передачи крысы до станции октября для изучения расположения пересаженные клетки и размер субретинальное пузырь.
3. впрыск лечение
-
Обезболивающее лечение противовоспалительными и боль
- Придать бупренорфина на 0,1 мг/кг веса тела в физиологического раствора подкожно, чтобы уменьшить боль.
- Придать дексаметазона в 1,6 мг/кг веса тела в солевых внутрибрюшинной инъекции (и.п.) для контроля воспаления.
-
Животных восстановления
- Возвращение крыса в клетке восстановления под лампой тепла для поддержания температуры тела.
- Соблюдайте оперированный глаз для признаков кровотечения.
- Наблюдать за крысу, чтобы убедиться, что он выходит из наркоза.
- Возвращение восстановленные животное в клетке свежие и флаг клетка с картой хирургии и ежедневно контролировать для каких-либо признаков бедствия, глазные кровоизлияния или помутнения роговицы. Немедленно уведомлять ветеринар, если есть проблемы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью метода, описанного в этой статье, мы последовательно выступил hRPESC НПП клетки в пространство субретинальное крыс RCS точно контролировать расположение, угол и глубину инжектор вставки иглы в ткани (рис. 1B- D ). Сразу же следующие трансплантации, экзамен октября была проведена соблюдать укола и субретинальное пузырь, созданный пересаженные клетки. Послеоперационные OCT оценки служит инструментом скрининг для оценки качества инъекции и мониторинга за повреждение сетчатки или кровоизлияния. Обе субретинальное пузырь (Рисунок 2A, C и D) и узел впрыска (рис. 2A и B) можно увидеть четко под OCT сканирование. Субретинальное пузырь обычно разрешается в течение 24 часов после инъекции. Хотя измерение размера шелесту трудно, используя OCT, мы можем оценить области пузырь, предполагая, что она равна области сохранения фоторецепторных клеток трансплантации. Ранее мы показали, что в 1 мкл инъекций 50 000 клеток может привести к экономии около 6-7% области RCS сетчатки вокруг узла впрыска13. Как показано на рисунке 2A, C и D, сетчатки, что слои были нетронутыми в месте инъекции, кровь не был обнаружен в пузырь, и никакие клетки были замечены в стекловидное тело, демонстрируя минимальной травмы, вызванной инъекции. Кроме того представитель OCT изображения неудачных инъекций были также включены для справки (Рисунок 2E и F).
С помощью OCT как инструмент обратной связи мы оптимизировали угол и глубину инжектор иглы в ткани. После того, как оптимизированы, не этот метод позволил нам добиться успеха 90,8% субретинальное доступа с только 5,7% хирургических, основываясь на результатах более чем 300 предыдущих субретинальное инъекции, в наших других исследований13 (Таблица 1). В оставшиеся 3,5% ОКТС не были выполнены по нескольким причинам, в том числе глаза не в надлежащей позиции из-за изофлюрановая анестезии связанные глаз прокатки17.
7 дней после трансплантации оперированных крыс глаза были энуклеированные, фиксированной и секционного иммуногистохимического анализа. Ядерные маркер (Hunu) клеток человека18 и ПЭС по ячейке маркер (OTX2)19 были использованы для обнаружения пересаженные клетки. На рисунке 3 показан толстый слой пересаженные клетки НПП в субретинальное пространстве, что, одной недели после инъекции, положительно витражи с обоих маркеров, подтверждающие личность и успешной доставке трансплантации. На одну неделю после инъекции большое количество ячеек, как показано на рис. 3 c, может быстро отказаться небольшое число позднее вследствие иммунного ответа даже в крыс RCS ослабленным20. Тем не менее как упоминалось выше, выродились фоторецепторных слой глаза крыс RCS можно найти быть спасены по крайней мере 2 месяца после пересадки с hRPESC НПП13.
Рисунок 1 : Изображение 4 - неделя старый клеток hRPESC НПП P2 и демонстрация угол и глубину, что инжектор иглу использует во время инъекции. (A фазово контрастной изображение 4 - неделя старый клеток hRPESC НПП P2 используется для инъекций. Шкалы бар = 100 µm. (B) схемы показаны 600 мкм расстояние между краем маркера и кончик иглы форсунки измеряется микромасштабной. Минимальный градации микромасштабной является 100 µm. (C) A мультфильм показаны сечения анатомические структуры глаза крыс и сбоку угол и глубину, что инжектор иглу вставляет в стенке глаза. Ученический оси глаза крыс составляет 30 градусов по отношению к столешнице и инжектор иглу – 15 градусов относительно местных поверхности глазного яблока. (D) мультфильм показаны отправной точкой маркера на инжектор иглу и вид сверху укола, где 500 мкм инжектор иглу вставляется в ткани и 100 мкм пространство остается между открытие отверстия впрыска и краем marke р. отверстия расположен в 1200-1500 мкм кзади лимба. Кончик иглы показано на его стороне, но должно быть лицом вниз во время инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Октября изображения оперированных крыс глаза сразу же после инъекции. (A) образ OCT Б-скан оперированный глаз показаны субретинальное пузырь и инъекции сайта, без интравитреальные кровоизлияния. (B октября интенсивности проекции (VIP) образ тома серии B-скан, представляющий изображение глазного дна аксессуары области вводится. Место небольшой инъекции в VIP изображении показаны минимальная травма. (C) увеличенного изображения OCT () Показать пересаженные клетки в субретинальное пространстве со всех слоев сетчатки отмечен. Этот образ продемонстрировал, что пересаженные клетки были расположены в субретинальное пространстве. (D) OCT Б-скан изображения показаны средний размер субретинальное пузырь. (E) OCT Б-скан изображения показаны неудачных субретинальное инъекции с CS, расположенных в пространстве интравитреальные. (F) OCT Б-скан изображения показаны неудачных субретинальное инъекций с всю сетчатку, poking через в месте инъекции. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Иммуногистохимического окрашивания сетчатки Замороженные разделы после трансплантации клеток hRPESC ПЭС. (A) человеческих клеток ядерной маркер (Hunu) пятная указанием обнаружения пересаженные клетки человека НПП. (B, E) Счетчик клеток ядерной окрашивание (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) показаны слоях сетчатки, пересадки и ПЭС слоя. (C) A объединенное изображение Hunu и DAPI, указав, что пересаженные hRPE клетки расположены в пространстве субретинальное. Разделение между пересадки и ПЭС слой является обработка артефакт, связанный с крио защита RCS глаза для замороженных секций. (D) НПП клеток маркер (OTX2) пятная пересаженные клетки человека ПЭС. (F объединенного изображения OTX2 и DAPI. Шкалы бар = 20µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Общая вводят глаза крыс RCS | Хороший субретинальное шелесту под OCT | Малые субретинальное шелесту под OCT | Общая неосложнённой субретинальное шелесту под OCT | Сложности субретинальное шелесту под OCT (то есть пузырьков воздуха в нем или кровоизлияния сетчатки) | Выполнена не Окт | Хирургическое сбой (не субретинальное пузырь под OCT) | |
| Количество | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % от всего вводили глаз | ------ | 82,80% | 7,96% | 90.76% | 1.59% | 1.91% | 5.73% |
| (Эти данные взяты из десяти когорты субретинальное инъекции в крыс RCS) | |||||||
Таблица 1: Резюме субретинальное инъекции из десяти экспериментальных когорт в крыс RCS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Техника субретинальное инъекции, изображенные в этой статье осуществляется через транс склеры путь, где инжектор иглу проникает внешние слои (склера Хориоидея НПП комплекс) глаз стены без ущерба нейронных сетчатки или нарушая полости стекловидного тела. Альтернативные транс vitreal подход имеет потенциальный риск повреждения объектива, ведущих к катаракте, поскольку грызуны объектив занимает большинство из полости стекловидного тела. По сравнению с этот метод, наша техника является менее рискованным и вызывает минимальная травма, как иглы форсунки не нужно идти через весь стекловидного достичь субретинальное пространства. Действительно OCT экзамены в наших исследованиях показали очень редко сетчатки проникновения события, и в последующих экзаменов в животных, есть нет постоянных отслоения сетчатки. Кроме того, место инъекции очень мала (< 200 мкм в диаметре) когда с помощью 33-калибруйте инжектор иглу таким образом структурные нарушения склера Хориоидея НПП комплекса является весьма ограниченным. После втягивания иглы инъекции отверстие самостоятельной уплотнения автоматически так ни строчки или ткань клей требуется.
Осложнения с хирургии включают в себя чрезмерное кровотечение вокруг области инъекций или в направляющее отверстие. При использовании щипцов для захвата конъюнктивы разницы на лимба, только нежный силы необходима во избежание защемления кровеносных сосудов и уменьшить возможные кровотечения. Перед созданием пилотной скважины, изучите сайт предполагаемой инъекции, чтобы избежать проникновения поверхностных кровеносных сосудов. С помощью копья, направляющее отверстие может быть очищен от крови до вставки ячейки инъекционной иглы. Если кровотечение из пилотной скважины сохраняется после нескольких применений копье, судно может были нарушены. Еще одна сложность, которую мы наблюдали это небольшой процент крыс RCS постоперационно развивающихся помутнения роговицы. В некоторых случаях помутнения были хронические и другие были переходные. Животные с стойких помутнения были удалены из исследовательской группы. Помутнения роговицы может развиться из-за сухость глаз, физический ущерб, воспаление, наркотики или химическое раздражение21. Чтобы уменьшить их формирования, глаза должны храниться влажной, поддерживая широкие глаза смазкой и не прикасайтесь роговицы с хлопка аппликатор или другие инструменты во время операции.
Протокол инъекции изложенные здесь использует определенный подход углов и иглы глубины относительно глазной достопримечательности и углы глаз по отношению к таблице хирургические в нашей структуре. Использование впрыск OCT сканирования имеет важное значение в уточнении этих параметров впрыска обеспечить воспроизводимость управления НПП трансплантации клеток в крыс субретинальное пространство с высокой точностью. Как только освоил неоднократные практикой, метод прост для выполнения. Это рекомендуется, особенно в области подготовки кадров, что послеоперационные глазной экзамены проводятся для определения результатов. Угол и глубина инъекции игла будет скорее всего необходимость перестройки соответственно к этой обратной связи в зависимости от хирургического set-up, возраст животного, или при использовании других видов животных (например, мышь).
Чтобы оценить качество инъекций и определить включение или исключение из исследования, наличие subretinal кровью от октября наблюдение имеет решающее значение. В лабораториях, где OCT недоступен, критерии, описанные ниже может использоваться для быстрого скрининга хирурги исключить сбой предполагаемых инъекций: (1) до инъекции: (a) пилот отверстие делается слишком глубоко (например, значительные глубины > 500 мкм; для бренд инсулин иглы, используемые здесь, расстояние от кончика иглы в середине скоса — 500 мкм). (b) направляющее отверстие кровоточить чрезмерно (т.е., кровотечение нельзя остановить применения силы на отверстие с Спирс глаз). (c Инъекционная игла идет слишком глубоко (например, значительные глубины > 500 мкм или маркер на иглу переходит в сложные ткани склера/сосудистая оболочка/НПП). (2) во время инъекции: (a) не удается поддерживать иглу в направляющее отверстие во время инъекции. (b) утечки непосредственно вокруг инъекционной иглы во время инъекции. (c иглу помещается слишком глубоко (например, маркер на иглу переходит в сложные ткани склера/сосудистая оболочка/НПП) как заметили хирург во время инъекции. (d) удалось сохранить иглу в положении для более чем 5 секунд после инъекции. (e) чрезмерное крови при отзыве инъекционной иглы. (f) не противотока/измеряем видели после втягивания инъекционной иглы при сочетании с шага 2.
Вместе взятые, с тщательного управления расположения иглы, углов и глубины, техника транс склеры субретинальное инъекции очень надежной, точной и может нести минимальные хирургической травмы. С учетом всех этих преимуществ этот метод может использоваться не только для доставки НПП клеток, но и для других типов клеток, соединений или генной терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотим поблагодарить Patty Lederman за ее помощь по хирургии и Сьюзен Борден НПП клеток подготовки. Мы также признаем NYSTEM C028504 для финансирования этого проекта. Жюстин D. Миллер поддерживается NIH Грант F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P.
