MitoCeption: העברת המיטוכונדריה MSC אדם מבודד בתאי גזע Glioblastoma
Summary
כאן, פרוטוקול (MitoCeption) מוצג להעביר המיטוכונדריה, מבודדת מתאי גזע mesenchymal אדם (MSC), לתאי גזע גליובלסטומה (GSC), במטרה ללמוד ההשפעות הביולוגיות שלהם על מטבוליזם ופונקציות GSC. פרוטוקול דומה ניתן להתאים להעביר המיטוכונדריה בין סוגי תאים אחרים.
Abstract
המיטוכונדריה לשחק תפקיד מרכזי בחילוף החומרים בתא, ייצור אנרגיה ובקרה של אפופטוזיס. במיטוכונדריה הלקויה כבר נמצאה אחראי מחל מגוונות מאוד, החל פתולוגיות נוירולוגיות לסרטן. מעניין לציין, כי המיטוכונדריה הוכחה לאחרונה כדי להציג את היכולת שיועבר בין סוגי תאים, בעיקר מתאי גזע mesenchymal אדם (MSC) לתאים סרטניים בתנאי coculture, עם השלכות מטבוליות פונקציונליות תאי הנמען המיטוכונדריה, עוד שיפור הריבית הנוכחית עבור התכונות הביולוגיות של אברונים אלה.
הערכת ההשפעות של המיטוכונדריה הועבר MSC בתאי המטרה היא בעלת חשיבות מרכזית להבנת התוצאה הביולוגית של אינטראקציות תאים תאים כאלה. פרוטוקול MitoCeption המתואר כאן מאפשר העברת המיטוכונדריה מבודד מראש מתאי התורם לתאי היעד, באמצעות המיטוכונדריה MSCותאי גזע גליובלסטומה (GSC) כמערכת מודל. פרוטוקול זה נעשה שימוש בעבר להעביר המיטוכונדריה, מבודד MSCs, כדי חסיד תאים סרטניים מד"א- MB-231. פרוטוקול העברת המיטוכונדריה זה מותאם כאן GSCs המציג את הייחוד הספציפי של גדל כמו neurospheres במבחנה. העברת המיטוכונדריה המבודד ניתן ואחריו תא קרינת מיון מופעל (FACS) והדמית confocal באמצעות המיטוכונדריה צבעים חיוניים. השימוש בתאי תורם היעד המיטוכונדריה עם haplotypes הברור (SNPs) גם מאפשר זיהוי של המיטוכונדריה הועבר מבוסס על הריכוז של הדנ"א המיטוכונדרי חדרם (mtDNA) בתאי המטרה. לאחר הפרוטוקול יאומת עם קריטריונים אלה, התאים מחסת המיטוכונדריה הועברה ניתן לבצע עיבוד נוסף כדי לקבוע את ההשפעות של המיטוכונדריה אקסוגניים על תכונות ביולוגיות כגון חילוף חומרים בתא, פלסטיות, שגשוג ואת תגובה לטיפול.
Introduction
המיטוכונדריה הם אברונים המצוי בתאי איקריוטיים שבו הם משחקים תפקיד מרכזי ספיגת חומרים מזינים כמו גם בייצור אנרגיה המטבוליט. אברונים אלה מכילים DNA המיטוכונדרי עגול (mtDNA), ארוך 16.6 kb, המקודד חלבונים של מתחמי שרשרת העברת אלקטרונים, tRNAs ו rRNAs 1. הפונקציונליות של אברונים אלה חיונית הומאוסטזיס תא וכמה פתולוגיות קושרו עם המיטוכונדריה בתפקוד 1, 2, 3. מעמדו המיטוכונדריה יש למשל נקשר דלקת, מחלות זיהומיות וסרטן, במקרה זה האחרון שיש לו השלכות על גרורות והתנגדות לטיפול 4, 5, 6, 7.
המיטוכונדריה להציג את היכולת המדהימה של מקבל מועברים בין "תורם" ותאיים "יעד". זה מוביל לשינויים במטבוליזם האנרגטי של תאי היעד, כמו גם שינויים פונקציונליים אחרים כגון ריפוי רקמות ועמיד בפני תרופות כימותרפיות, כפי שמוצג לאחרונה על ידי מעבדות שונות 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. תאי הגזע mesenchymal האדם (MSCs) להציג את היכולת הזו כדי להעביר המיטוכונדריה למגוון רחב של תאים היעד, כולל שריר הלב, תאי אנדותל, תאי אפיתל המכתשית ריאתי, תאים צינורי כליות ותאי סרטן, מה שמוביל שינויים של תכונות פעילות של תאים אלה 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
המיטוכונדריה החליפין כעת נראה כמנגנון בשימוש נרחב המאפשר מספר תאים מסוגים שונים כדי לתקשר אחד עם השני ולשנות התכונות הביולוגיות שלהם. חילופי המיטוכונדריה זה יכול להתרחש דרך צינורות מנהור היווצרות (TNT), מעורבים צמתים הפער המכילים 43 connexin 8 או M-Sec / TNFaip2 ואת exocyst 19 מורכבים. לחילופין, העברת המיטוכונדריה הוצגה גם בתיווכה arrestin המכילים תחום חלבון microvesicles 1 בתיווך (ARMMs) 20. מעניין, את היעילות של העברת המיטוכונדריה היה צמוד לשער ביטוי של 1 GTPase Rho MIRO1 21, גורם מפתח להסברת ההבדלים efficacies העברת המיטוכונדריה בין iPSC-MSCs ומבוגר BM-MSCs 22.
למרות העושר הזה של נתונים בדבר תא אל תא חליפין המיטוכונדריה, מעט יחסית ידוע על מטבוליות התוצאה ביולוגית של העברת המיטוכונדריה זה. לכן, זה לגמרי מצדיק הקים את הכלים המתאימים על מנת להעריך את ההשפעות הביולוגיות מלא מההעברה. במהלך השנים, גישות טכנולוגיות כמה להעביר המיטוכונדריה מתורם תאי acceptor הוצע. זה כולל הזרקה ישירה של המיטוכונדריה לתוך ביציות 23, 24, 25, איחוי תאים כדי ליצור cybrids transmitochondrial 26, 27 ולאחרונה, העברת המיטוכונדריה מבודד באמצעות photothermal nanoblades 28.
אנחנו ואחרים בעבר הדגימו את היכולת של mitochond המבודדריה להפנים תאים חיים, כפי שנצפה הן במבחנה in vivo 29, 30, 31, דרך המנגנונים המוצעים לערב macropinocytosis 32. בנוסף, אנו פתחנו שיטה, בשם MitoCeption, להעביר כמותית המיטוכונדריה מבודד (מ MSCs) כדי למקד תאים, כפי שהודגמו עם (החסיד) מד"א- MB-231 תאי סרטן שד קו 31. פרוטוקול זה הותאם כאן להעברת המיטוכונדריה MSC אדם המבודדת תאי גזע גליובלסטומה (GSCs).
גליובלסטומה הן גידולים ממאירים אגרסיביים של המוח במהירות לפתח עמידות לטיפול, בעיקר בשל תאי גזע גליובלסטומה (GSC) נוכחים בתוך הגידול 33. GSCs אלה גדלים כמו neurospheres במבחנה וליצור גידולים במודלים xenograft. יש תאים סרטניים בתוך גליובלסטומהיכולת לעשות תא אל תא קשרים, כפי שמוצג לאחרונה עבור תאים סרטניים במוח astrocytic כי קישוריות באמצעות microtubes המורחבת, שדרכו המיטוכונדריה (וכן גרעיני סידן תא) יכולה להעביר, וכתוצאה מכך רשתות אסטרוציטומה עמידות הקרנות 34. גליובלסטומה יכול לגייס תאים שונים בתוך microenvironment הגידול, כולל MSCs 35, 36. הראינו כי MSCs יכול ליצור קשרים תאים תאים עם GSCs ב coculture ולהעביר המיטוכונדריה שלהם (מידע לא מוצג), אשר צפויה לשנות תכונות פעילות GSC. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד הטכניקה MitoCeption ניתן להשתמש כדי להעביר המיטוכונדריה, לפני כן מבודד MSCs האדם, כדי GSCs אדם עם לצורך קביעת התוצאה ביולוגי הפעילות שלהן. מולטיפוטנטיים ומאוד tumorigenic קו Gb4 GSC 37 נעשה שימוש במחקר זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
מספר גדל והולך של מחקרים מראה כי תא יכול להחליף מיטוכונדריה כי המיטוכונדריה אלה יש השפעה עמוקה על חילוף החומרים בתא המטרה ופונקציות. לכן, זה הכרחי כדי להשתלט על הכלי להעביר המיטוכונדריה כמותית מתאי התורם לתאי היעד הבאים כדי לאפשר מחקר מדויק של ההשפעות הביולוגיות שלה…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים אנדריאה Parmeggiani (L2C ו DIMNP, מונפלייה), בנואה שארלו (IES, מונפלייה) וכן אנשי המעבדה לדיונים מועילים, כריסטוף Duperray לעזרה עם ניתוח FACS, מתקן הדמיה RIO מונפלייה (MRI) למתן סביבה נאותה עבור FACS ו מיקרוסקופיה confocal. Bnm נתמכה על ידי מענק בוגר LabEx Numev (האמנה ANR-10-LABX-20). AB נתמכה על ידי עמיתי ראשון מאוניברסיטת ורשה והאיחוד האירופי (N ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV הוא מדען צוות מהמרכז הלאומי למחקר מדעי (CNRS).
Materials
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
| N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
| poly Heme | Sigma | P3932 |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
| DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
| Glucose | Sigma | G7021 |
| Insuline | Sigma | I 1882 |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| CaCl2 | MERCK | 2382 |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 |
| Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
