MitoCeption는 : 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아 전송
Summary
여기에, 프로토콜 (MitoCeption)는 GSC 대사와 기능에 대한 생물학적 효과를 연구 목적으로, 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 위해 제공됩니다. 유사한 프로토콜이 다른 세포 유형 간 미토콘드리아를 전송하도록 구성 될 수있다.
Abstract
미토콘드리아는 세포 대사, 에너지 생산 및 세포 사멸의 제어를위한 중심적인 역할을한다. 부적절한 미토콘드리아 기능은 신경 학적 병변에서 암에 이르기까지 매우 다양한 질병에 대한 책임이 발견되었다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 최근 용량을 표시하도록 도시 된 상기 현재 관심을 향상 미토콘드리아받는 세포 대사 및 기능적 결과와 공 배양 조건에서 암 세포에 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC)에서 특히 세포 유형 사이에서 전송 될 이러한 세포 소기관의 생물학적 특성에 대한.
표적 세포에서 전사 MSC 미토콘드리아의 효과를 평가하는 것은 예컨대 세포 – 세포 상호 작용의 생물학적 결과를 이해하기 위해 가장 중요하다. 여기에 설명 MitoCeption 프로토콜 MSC 미토콘드리아를 이용하여 표적 세포를 도너 세포로부터 미리 격리 미토콘드리아의 전송을 허용모델 시스템으로서 교 모세포종 및 줄기 세포 (GSC). 이 프로토콜은 이전에 MDA-MB-231 유방암 세포를 접착하는 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 격리를 전송하는 데 사용되었다. 이것은 미토콘드리아 전송 프로토콜은 체외로 neurosphere를 성장시키는 특정 특이성을 제시 GSC를 여기하도록 구성된다. 격리 된 미토콘드리아의 전달은 미토콘드리아에게 중요한 염료를 사용하여 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)와 공 초점 이미징 다음에 할 수 있습니다. 별개의 일배 체형 (SNP가)와 미토콘드리아 공여체 및 목표 세포의 사용은 또한 표적 세포에서의 원형 미토콘드리아 DNA (미토콘드리아)의 농도에 기초하여 상기 전송 된 미토콘드리아의 검출을 허용한다. 프로토콜이 이러한 기준을 검증 한 후에, 전사 된 미토콘드리아 형질 세포를 상기와 같은 세포 대사, 소성, 증식 및 치료에 대한 응답으로서 생물학적 특성에 외인성 미토콘드리아의 효과를 결정하기 위해 분석 될 수있다.
Introduction
미토콘드리아는 영양소 흡수뿐만 아니라 에너지 대사 산물 생산의 중심적인 역할을 진핵 세포에서 발견되는 세포 내 소기관이다. 이 세포 소기관은 원형 미토콘드리아 DNA 전자 수송 체인 단지,의 tRNA 및 rRNAs 1의 단백질을 인코딩 16.6 KB 긴 (미토콘드리아 DNA)를 포함합니다. 이러한 소기관의 기능은 세포 항상성 여러 병리는 미토콘드리아 장애 1, 2, 3과 연관되어 매우 중요하다. 미토콘드리아 상태는 예를 들어 치료를 4, 5, 6, 7 전이 저항에 대한 영향이 후자의 경우에, 염증, 감염증, 암에 연결되어있다.
미토콘드리아는의 놀라운 능력을 표시 "기증자"과 "대상"세포 사이에 전송하기. 최근에, 15 개의 실험실 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14에 의해 도시 된 바와 같이,이 같은 조직 복구 및 화학 요법 제에 대한 저항성과 같은 다른 기능적인 변형뿐만 아니라 표적 세포의 에너지 대사의 변화를 초래 16. 인간 중간 엽 줄기 세포 (MSC들)이 세포의 기능적 특성의 변형 선도, 심근 세포, 내피 세포, 폐의 폐포 상피 세포, 신 세뇨관 세포와 암 세포를 포함하여 표적 세포의 매우 다양한 미토콘드리아를 전송하는 이러한 능력을 표시 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
미토콘드리아 교환 이제 다른 세포 유형의 수가 서로 통신 및 생물학적 특성을 수정할 수있는 광범위하게 사용되는 메커니즘으로 나타난다. 이 미토콘드리아 교환은 19 복잡한 넥신 43 함유 간극 연접 8 또는 M-초 / TNFaip2 및 exocyst를 포함하는, 터널링 나노 튜브 (TNT) 형성을 통해 발생할 수 있습니다. 대안 적으로, 미토콘드리아 전송은 도메인 함유 단백질 일 매개 마이크로 소포 (ARMMs) 20 아레스에 의해 매개되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 전송의 효능는 GTPase ρ-1의 발현 속도 MIRO1 21 iPSC- 간의 미토콘드리아 전사 효능의 차이를 설명하기위한 핵심 요소에 링크 된중간 엽 줄기 세포와 성인 BM-중간 엽 줄기 세포 22.
세포 간 미토콘드리아 교환에 관한이 데이터 부에도 불구하고, 상대적으로 적은이 미토콘드리아 전송의 대사 및 생물학적 결과에 대해 공지되어있다. 따라서,이 완전히 충분히 전달의 생물학적 효과를 평가하기위한 적절한 툴을 설정 보증. 수년에 걸쳐, 여러 기술적 접근법 수용체 세포 공여자로부터 미토콘드리아를 전송하는 것이 제안되어있다. 이것은 27 transmitochondrial cybrids (26)를 생성하는 난자 23, 24, 25, 세포 융합으로 미토콘드리아의 직접 분사를 포함 그리고, 최근, 광열를 사용하여 격리 된 미토콘드리아의 전송은 28 nanoblades.
우리는 이전과 다른 절연 mitochond의 능력을 입증시험 관내 및 생체 내 모두에서 관찰 RIA는 살아있는 세포에 의해 내부화 될 메커니즘을 통해 29, 30, 31, macropinocytosis (32)을 포함 할 것을 제안. 우리는 더 정량적 (점착성)로 예시 된 바와 같이, 표적 세포 MDA-MB-231 유방암 세포주 (31) (MSC들)에서 격리 된 미토콘드리아를 전송하기 MitoCeption라는 방법을 개발 하였다. 이 프로토콜은 아교 모세포종 줄기 세포에 고립 된 인간의 MSC 미토콘드리아의 전송 (GSC를) 여기 적응했다.
교 모세포종은 빠르게 주로 종양 (33) 내에 존재하는 아교 모세포종 줄기 세포 (GSC)로, 치료에 내성 뇌의 적극적인 악성 종양이다. 이 GSC를 시험관에서 neurosphere를로 성장하고 이종 이식 모델에서 종양을 생성합니다. 아교 모세포종 내 암 세포를방사선 내성 성상 네트워크 (34)에 생성 된 확장 된 모세관을 통해 상호 연결되는 미토콘드리아 (또한 칼슘 세포 핵)을 통해 이전 할 수 성상 뇌종양 세포에 대해 최근에 도시 된 바와 같이, 용량은 세포 간 연결을한다. 아교 모세포종은 MSC들 (35), (36)를 포함하여 종양 미세 환경 내에서 여러 셀을 채용 할 수있다. 우리는 중간 엽 줄기 세포를 공 배양에 GSC를 가진 세포 – 세포 연결을하고 GSC 기능적 특성을 수정할 것으로 예상된다 그들의 미토콘드리아 (도시되지 않은 데이터)를 전송할 수 있음을 보여 주었다. 본 프로토콜은 MitoCeption 기법 기능적 생물학적 결과를 결정하기위한 목적으로 인간에게 GSC를 인간 중간 엽 줄기 세포에서 미토콘드리아 절연 미리 전송하는 방법을 설명한다. 능성 높은 종양 GB4 GSC 라인 37는이 연구에 사용 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
연구의 증가는 세포가 미토콘드리아를 교환 할 수 있고 이러한 미토콘드리아 표적 세포 대사와 기능에 심각한 영향을 보여준다. 따라서, 양적으로 생물학적 효과의 정확한 연구 있도록이 표적 세포에 공여 세포에서 미토콘드리아를 전송하는 툴을 습득하는 것이 필수적이다.
여기에 설명 된 프로토콜은 원래 점착성 암 세포주 MDA-MB-231 33 인간 중간 엽 줄기 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론에 대한 실험실의 구성원뿐만 아니라 안드레아 Parmeggiani (L2C 및 DIMNP, 몽펠리에), 벤와 샬럿 (IES, 몽펠리에를) 감사합니다, 크리스토프 Duperray를 제공하기위한 FACS 분석은 몽펠리에 RIO 영상 설비 (MRI)에 대한 도움말 FACS와 공 초점 현미경에 적합한 환경을 제공합니다. BNM은 LABEX Numev (규칙은 ANR-10 LabX에-20)에서 대학원 친교에 의해 지원되었다. AB 바르샤바과 유럽 연합 (EU)의 대학에서 학사 교제에 의해 지원되었다 (N POKL.04.01.02-00-221 / 12 °). MLV는 과학 연구를위한 국립 센터 (CNRS)에서 직원 과학자입니다.
Materials
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
| N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
| poly Heme | Sigma | P3932 |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
| DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
| Glucose | Sigma | G7021 |
| Insuline | Sigma | I 1882 |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| CaCl2 | MERCK | 2382 |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 |
| Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
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