MitoCeption: Overførsel isoleret humant MSC Mitokondrier til Glioblastoma Stamceller
Summary
Her er en protokol (MitoCeption) præsenterede at overføre mitokondrier, isoleret fra humane mesenkymale stamceller (MSC), til glioblastom stamceller (GSC), med det mål at studere deres biologiske virkninger på GSC metabolisme og funktioner. En lignende protokol kan tilpasses til at overføre mitokondrier mellem andre celletyper.
Abstract
Mitokondrier spiller en central rolle for cellens stofskifte, energiproduktion og kontrol af apoptose. Utilstrækkelig mitokondriefunktionen har vist sig ansvarlig for meget forskellige sygdomme, der spænder fra neurologiske patologier til kræft. Interessant nok har mitokondrier nylig vist at vise evnen til at blive overført mellem celletyper, navnlig fra humane mesenchymstamceller (MSC) til cancerceller i cokultur betingelser, med metaboliske og funktionelle konsekvenser for mitokondrierne recipientceller, yderligere forøgelse af det aktuelle interesse for de biologiske egenskaber af disse organeller.
Evaluering af virkningerne af den overførte MSC mitokondrier i målcellerne er af største betydning for at forstå den biologiske resultatet af disse celle-celle-interaktioner. Den her beskrevne MitoCeption protokollen gør det muligt at overføre mitokondrierne isolerede forhånd fra donor celler til målcellerne, hjælp MSC mitokondrierog glioblastoma stamceller (GSR) som et modelsystem. Denne protokol er tidligere blevet anvendt til at overføre mitokondrier isoleret fra MSC'er, at adhærente MDA-MB-231 cancerceller. Denne mitokondrier transfer protocol er tilpasset her GSCS der udgør den specifikke særlige ved vokser som neurosfærer in vitro. Overførsel af de isolerede mitokondrier kan følges ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og konfokal billeddannelse under anvendelse mitokondrier vitale farvestoffer. Brugen af mitochondrier donor- og target celler med forskellige haplotyper (SNP'er) tillader også påvisning af de overførte mitokondrier baseret på koncentrationen af deres cirkulære mitokondrie-DNA (mtDNA) i målcellerne. Når protokollen er blevet valideret med disse kriterier, kan de celler, der huser de overførte mitokondrier yderligere analyseret for at bestemme virkningerne af de eksogene mitokondrier på biologiske egenskaber såsom cellens stofskifte, plasticitet, spredning og respons på behandling.
Introduction
Mitokondrier er organeller, der findes i eukaryote celler, hvor de spiller en central rolle i optagelsen af næringsstoffer samt i energi- og metabolit-produktion. Disse organeller indeholder cirkulære mitokondrie-DNA (mtDNA), 16,6 kb lang, der koder for proteiner af elektrontransportkæden komplekser, tRNA'er og rRNA'er 1. Funktionaliteten af disse organeller er kritisk for cellehomeostase og adskillige patologier er blevet forbundet med mitokondrier dysfunktion 1, 2, 3. Den mitokondrier status for eksempel været forbundet med inflammation, infektionssygdomme og cancer, i sidstnævnte tilfælde med konsekvenser for metastase og modstandsdygtighed over for terapi 4, 5, 6, 7.
Mitokondrier vise den bemærkelsesværdige evne blive overført mellem "donor" og "mål" celler. Dette fører til ændringer i den energiske metabolisme af målcellerne såvel som i andre funktionelle modifikationer, såsom vævsreparation og modstandsdygtighed over for kemoterapeutiske midler, som for nyligt vist ved forskellige laboratorier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. De humane mesenkymale stamceller (MSC'er) viser denne evne til at overføre mitokondrier til en bred vifte af målceller, herunder cardiomyocytter, endotelceller pulmonale alveolære epitelceller, renale tubulære celler og cancerceller, hvilket fører til ændringer af de funktionelle egenskaber af disse celler 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitokondrier udveksling fremstår nu som en meget anvendt mekanisme, der tillader et antal forskellige celletyper til at kommunikere med hinanden og ændre deres biologiske egenskaber. Denne mitokondrier udveksling kan ske gennem tunneling nanorør (TNT) dannelse, der involverer connexin 43-holdige gap junctions 8 eller M-Sec / TNFaip2 og exocyst komplekse 19. Alternativt blev mitokondrier overførsel også vist at være medieret af arrestin-domæne-holdige protein 1-medierede mikrovesikler (ARMMs) 20. Interessant nok blev effekten af mitokondrierne overførsel knyttet til udtrykket satsen for Rho GTPase en MIRO1 21, en afgørende faktor for at forklare forskellene i mitokondrier overføre effektiviteter mellem iPSC-MSC og voksen BM-MSC 22.
På trods af dette væld af data om celle-til-celle mitokondrier udveksling, er relativt lidt kendt om metabolisk og biologisk resultat af denne mitokondrier overførsel. Derfor er det fuldt ud berettiger oprette de nødvendige værktøjer til fuldt ud at vurdere de biologiske virkninger af denne overførsel. I årenes løb til adskillige tekniske metoder overføre mitokondrier fra donor til acceptor-celler er blevet foreslået. Dette omfatter direkte injektion af mitokondrier i oocytter 23, 24, 25, cellefusion at generere transmitochondrial cybrids 26, 27 og for nylig, overførsel af isolerede mitokondrier hjælp fototermisk nanoblades 28.
Vi og andre tidligere påvist kapacitet isolerede mitochondria skal internaliseres af levende celler, som observeret både in vitro og in vivo 29, 30, 31, gennem mekanismer foreslået at inddrage macropinocytosis 32. Vi udviklede endvidere en fremgangsmåde, kaldet MitoCeption, for kvantitativt at overføre isolerede mitokondrier (fra MSC'er) til målceller, som eksemplificeret med (klæbende) MDA-MB-231 brystcancercellelinje 31. Denne protokol blev tilpasset her til overførsel af isolerede humane MSC mitokondrier til glioblastom stamceller (GSCS).
Glioblastoma er aggressive maligne tumorer i hjernen, der hurtigt bliver resistente over for behandling, primært som følge af glioblastom stamceller (GSC) til stede i tumoren 33. Disse GSCS vokse som neurosfærer in vitro og generere tumorer i xenograftmodeller. Cancerceller inden glioblastom harkapacitet til at gøre celle-til-celle-forbindelser, som vist for nylig for astrocytiske hjerne tumorceller, interconnect via udvidede mikrorør, hvorigennem mitochondrier (samt calcium- og cellekerner) kan migrere, hvilket resulterer i radioterapi-resistent astrocytom net 34. Glioblastom kan rekruttere mange forskellige celler i tumoren mikromiljø, herunder MSC'er 35, 36. Vi viste, at MSC kan gøre celle-celle-forbindelser med GSCS i cokultur og overføre deres mitokondrier (data ikke vist), hvilket forventes at modificere GSC funktionelle egenskaber. Den nuværende protokol beskriver, hvordan MitoCeption teknik kan bruges til at overføre mitokondrier, isoleret på forhånd fra humane MSC'er, menneskelige GSCS med henblik på fastlæggelsen af deres funktionelle biologiske resultat. Den multipotente og yderst tumorigene GB4 GSC linie 37 blev anvendt i denne undersøgelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et stigende antal undersøgelser viser, at cellerne kan udveksle mitokondrier, og at disse mitokondrier har dybtgående virkninger på målcellens stofskifte og funktioner. Derfor er det vigtigt at beherske de værktøjer, der kan hældes mitokondrier fra donorcellerne til disse målceller for at muliggøre en nøjagtig undersøgelse af deres biologiske virkninger.
Protokollen beskrevet her var oprindeligt arbejdede til overføre mitokondrier isoleret fra humane mesenkymale stamceller til de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Andrea Parmeggiani (L2C og DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) samt medlemmer af laboratoriet for nyttige diskussioner, Christophe Duperray efter hjælp til FACS-analyse, at Montpellier RIO imaging facilitet (MRI) for at give tilstrækkelig miljø for FACS og konfokal mikroskopi. BNM blev understøttet af en kandidat fællesskab fra LABEX Numev (konvention ANR-10-LabX-20). AB blev støttet af en bachelor stipendium fra universitetet i Warszawa og Den Europæiske Union (n ° POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV er et personale forsker fra National Center for videnskabelig forskning (CNRS).
Materials
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
| N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
| poly Heme | Sigma | P3932 |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
| DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
| Glucose | Sigma | G7021 |
| Insuline | Sigma | I 1882 |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| CaCl2 | MERCK | 2382 |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 |
| Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
