MitoCeption: Transferir humano isolado MSC mitocôndrias de células-tronco Glioblastoma

Summary

Aqui, um protocolo (MitoCeption) é apresentada para transferir mitocôndrias, isolado a partir de células estaminais mesenquimais humanas (MSC), para células estaminais glioblastoma (GSC), com o objectivo de estudar os seus efeitos biológicos sobre o metabolismo SGC e funções. Um protocolo semelhante pode ser adaptado para transferir as mitocôndrias entre outros tipos de células.

Abstract

As mitocôndrias desempenham um papel central para o metabolismo celular, a produção de energia e de controlo de apoptose. função mitocondrial inadequada foi encontrado responsável por doenças muito diversas, que vão desde patologias neurológicas ao câncer. Curiosamente, as mitocôndrias foram recentemente mostrado para exibir a capacidade de ser transferidos entre os tipos de células, nomeadamente a partir de células estaminais mesenquimais humanas (MSC) para as células cancerosas em condições de co-cultura, com metabólicas e funcionais consequências para as células mitocôndrias destinatários, aumentando ainda mais o interesse actual para as propriedades biológicas destes organelos.

Avaliação dos efeitos da mitocôndria MSC transferido nas células alvo é de importância primária para entender o resultado biológico de tais interacções célula-célula. O protocolo aqui descrito MitoCeption permite a transferência das mitocôndrias isoladas de antemão a partir das células dadoras para as células alvo, usando MSC mitocôndriase de células estaminais glioblastoma (GSC) como um sistema modelo. Este protocolo foi anteriormente usada para transferir as mitocôndrias, isolado a partir de MSC, para aderentes de células de cancro MDA-MB-231. Este protocolo de transferência de mitocôndrias é adaptado aqui para GSCS que apresentam a particularidade específica de crescer como neurospheres in vitro. A transferência das mitocôndrias isoladas pode ser seguido de células activadas por fluorescência (FACS) e de imagem confocal utilizando mitocôndrias corantes vitais. A utilização de doadores e células alvo as mitocôndrias, com diferentes haplótipos (SNPs), também permite a detecção das mitocôndrias transferidos com base na sua concentração de ADN mitocondrial circular (mtDNA) nas células alvo. Uma vez que o protocolo foi validado com estes critérios, as células que albergam as mitocôndrias transferidos pode ser ainda analisada para determinar os efeitos das mitocôndrias exógenos nas propriedades biológicas, tais como o metabolismo celular, plasticidade, proliferação e resposta à terapia.

Introduction

As mitocôndrias são organelos encontrados em células eucarióticas em que desempenham um papel central na absorção de nutrientes, assim como na produção de energia e de metabolito. Essas organelas contêm DNA mitocondrial circular (mtDNA), 16,6 kb de comprimento, que codifica as proteínas dos complexos da cadeia de transporte de elétrons, tRNAs e rRNAs ^1. A funcionalidade destes organelos é crítica para a homeostase celular e diversas patologias têm sido associados com a disfunção mitocondrial ^{1, 2, 3.} O estado mitocôndria tem, por exemplo, sido associados a inflamação, doenças infecciosas e cancro, neste último caso, com consequências para a metástase e resistência à terapia com ^{4, 5, 6, 7.}

Mitocôndrias exibir a capacidade notável de sendo transferidos entre "doadores" e células "alvo". Isto leva a mudanças no metabolismo energético das células-alvo, bem como em outras modificações funcionais, tais como a reparação e resistência aos agentes quimioterapêuticos tecido, como foi recentemente mostrado por diferentes laboratórios ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16.} As células estaminais mesenquimais humanas (MSCs) exibir esta capacidade de transferir mitocôndria para uma ampla variedade de células alvo, incluindo cardiomiócitos, células endoteliais, células epiteliais alveolares pulmonares, células tubulares renais e células cancerosas, conduzindo a alterações das propriedades funcionais destas células ^8,> ^{9, 10, 12, 17, 18.}

As mitocôndrias de troca aparece agora como um mecanismo amplamente utilizado que permite que um número de diferentes tipos de células para se comunicar uns com os outros e modificar as suas propriedades biológicas. Esta troca mitocôndrias pode ocorrer através da formação de túneis nanotubos (TNT), envolvendo conexina 43 contendo junções comunicantes ⁸ ou M-Sec / TNFaip2 eo exocyst complexos ^19. Alternativamente, a transferência de mitocôndrias também mostrou ser mediada por arrestina microvesículas proteína contendo o domínio 1-mediadas (ARMMs ^20). Curiosamente, a eficácia da transferência de mitocôndrias foi relacionado com a taxa de expressão da Rho GTPase 1 MIRO1 ^21, um factor chave para explicar as diferenças na mitocôndria eficácias de transferência entre iPSC-MSCs e adultos BM-MSCs ^22.

Apesar desta riqueza de dados relativos à troca de mitocôndria da célula-célula, relativamente pouco se sabe sobre a metabólico e resultados biológica dessa transferência mitocôndrias. Por isso, justifica plenamente a criação de instrumentos adequados para avaliar plenamente os efeitos biológicos desta transferência. Ao longo dos anos, várias abordagens técnicas para transferir mitocôndrias a partir de doadores de células aceitadores têm sido propostos. Isto inclui a injecção directa de mitocôndrias em oócitos de ^{23, 24, 25,} fusão celular para gerar cybrids transmitochondrial ^{26, 27} e, mais recentemente, a transferência de mitocôndrias isoladas usando fototérmico nanolâminas ^28.

Nós e outros já demonstraram a capacidade de mitochond isoladoRia para ser internalizada pelas células vivas, como observado tanto in vitro como in vivo ^{29, 30, 31,} através de mecanismos propostos para envolver macropinocitose ^32. Desenvolvemos também um método, chamado MitoCeption, para transferir quantitativamente mitocôndrias isoladas (a partir de MSCs) às células alvo, tal como exemplificado com o (aderente) MDA-MB-231 linha celular de cancro da mama ^31. Este protocolo foi adaptado aqui para a transferência de mitocôndrias isoladas de MSC humanas de glioblastoma células estaminais (GSCS).

O glioblastoma é um tumor maligno agressivo do cérebro que rapidamente se tornam resistentes ao tratamento, principalmente devido às células estaminais do glioblastoma (GSC) presentes no interior do tumor ^33. Estes GSCS crescer como neuroesferas in vitro e gerar tumores em modelos de xenoenxerto. As células cancerosas dentro de glioblastoma têm acapacidade para estabelecer ligações célula-para-célula, como demonstrado recentemente para as células tumorais do cérebro astrocíticos que interligam por meio de microtubos prolongadas, por meio da qual as mitocôndrias (bem como de cálcio e de células núcleos) pode migrar, resultando em redes astrocitoma radioterapia resistente ^34. Glioblastoma pode recrutar muitas células diferentes dentro do microambiente do tumor, incluindo o MSC ^{35, 36.} Nós mostramos que MSCs pode fazer conexões célula-célula com GSCS em co-cultura e transferir as suas mitocôndrias (dados não mostrados), que é esperado para modificar SGC propriedades funcionais. O presente protocolo descreve como a técnica MitoCeption pode ser usada para transferir as mitocôndrias, previamente isolado a partir de MSCs humanas, para GSCS humanos com a finalidade de se determinar o resultado biológico funcional. O multipotentes e altamente tumorigénicas linha GB4 SGC ³⁷ foi utilizado neste estudo.

Protocol

Dia 1 1. Rotulagem da Célula-tronco mesenquimais (MSC) As mitocôndrias (Opcional) Dois dias antes da preparação mitocôndrias, sementes MSCs humanas numa placa de cultura a 100 mm, em 10 ml de aMEM / FBS a 10%, de modo a ter 4 x 10 5 MSCs em cultura no Dia 1. Lavar as MSCs com PBS (4 mL) e adicionar 4 ml de aMEM / FBS a 1% (pré-aquecido a 37 ° C). Adicionar a quantidade necessária de mitocôndrias corante vital e incubar as células durante 30 mi…

Representative Results

Os passos processuais que descrevem o isolamento de mitocôndrias de células estaminais mesenquimais (MSC) e a sua transferência para as células-tronco glioblastoma segmentados (GSC) por MitoCeption são mostrados na Figura 1. GSCS são células-tronco cancerosas cultivadas como neurospheres para preservar suas propriedades de células-tronco. Para o protocolo, GSCS são semeadas como células individuais de um par de horas antes da transferência das mitocôndrias (p…

Discussion

Um número cada vez maior de estudos mostram que as células podem trocar mitocôndria e que estas mitocôndrias têm efeitos profundos sobre o metabolismo e as funções das células-alvo. Portanto, é essencial para dominar as ferramentas para transferir quantitativamente mitocôndrias das células do doador contra estas células alvo para permitir um estudo preciso dos seus efeitos biológicos.

O protocolo aqui descrito foi originalmente funcionou para transferir mitocôndrias isoladas de…

Materials

Mitochondria Isolation Kit for Tissue	Fisher Scientific	10579663
N-2 Supplement (100X)	Fisher Scientific	11520536
B-27 Supplement W/O VIT A (50X)	Fisher Scientific	11500446
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+	Sigma	H4385
poly Heme	Sigma	P3932
aMEM w/o glutamine	Ozyme	BE12-169F
DMEM/F-12 without glutamine,	Fisher Scientific	11540566
L-Glutamine	Invitrogen	25030-024
Glucose	Sigma	G7021
Insuline	Sigma	I 1882
Human bFGF	R&D Systems	233-FB-025
Human EGF	Peprotech	AF-100-15
Heparin	Sigma	H3149
CaCl2	MERCK	2382
Trypsine Inhibitor	Sigma	T9003
DNase I	SIGMA	10104159001
Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM	Invitrogen	25200056
Trypsin	Gibco	15090-046
Protease inhibitors EDTA free	Sigma	4693159001
Ciprofloxacine	Sigma	17850-5G-F
Fungine	Invivogen	ant-fn-1
Fungizone	Thermofisher	15290018
Gentamycin	Euromedex	EU0410
MitoTracker Green FM	Molecular Probes	M7514
MitoTracker Red CMXRos	Molecular Probes	M7512
MitoTracker Deep Red FM	Molecular Probes	M22426
CellTracker Green CMFDA	Molecular Probes	C7025
CellTracker Blue CMF2HC	Molecular Probes	C12881
RIPA	Santa Cruz	sc-24948
FluoroDish Sterile Culture Dish	World Precision Instruments	FD35-100
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110
FACS tubes	Beckman Coulter	2,523,749
FACS apparatus	Gallios	3L 10C
LC FAST START DNA MASTER PLUS	Roche	3515885001