MitoCeption: Передача Изолированные Человеческий MSC митохондрии глиобластомы стволовых клеток
Summary
Здесь протокол (MitoCeption) представлен для передачи митохондрии, выделенные из человеческих мезенхимальных стволовых клеток (MSC), к глиобластома стволовых клеток (GSC), с целью изучения их биологических эффектов на GSC метаболизм и функции. Аналогичный протокол может быть выполнен с возможностью передачи митохондрии между другими типами клеток.
Abstract
Митохондрии играют центральную роль для клеточного метаболизма, производства энергии и контроля апоптоза. Неадекватное митохондриальная функция была найдена ответственность за самых разнообразных заболеваний, начиная от неврологических патологий к раку. Интересно отметить, что митохондрии в последнее время было показано, чтобы отобразить способность передаваться между типами клеток, в частности, из мезенхимных стволовых клеток человека (MSC) для раковых клеток в условиях совместного культивирования, с последствиями метаболических и функциональных для клеток-реципиентов митохондрии, дальнейшее повышение тока интерес для биологических свойств этих органелл.
Оценивая последствия перенесенного MSC митохондрий в клетках-мишенях имеет первостепенное значение для понимания биологической исход таких межклеточных взаимодействий. Протокол MitoCeption, описанный здесь позволяет передавать митохондриях, выделенных предварительно из донорских клеток в клетки-мишени, с помощью MSC митохондриии глиобластомы стволовые клетки (GSC) в качестве модельной системы. Этот протокол ранее использовался для передачи митохондрии, выделенные из ПКЦ, чтобы приверженец раковых клеток MDA-MB-231. Этот протокол передачи митохондрии приспособлен здесь GSCs , которые представляют специфическую особенность выращивания в нейросферах в пробирке. Передача выделенных митохондрий может сопровождаться флуоресцентно-активированных клеток (FACS сортировочный) и получения изображений с использованием конфокальной митохондрии витальных красителей. Использование митохондрии донора и клеток-мишеней с различными гаплотипов (SNP) также делает возможным обнаружение передаваемых митохондрий на основе концентрации их округлой митохондриальной ДНК (мтДНК) в клетках-мишенях. После того, как протокол был утвержден с этими критериями, клетки, несущие передаваемые митохондрии могут быть дополнительно проанализированы с целью определения влияния экзогенных митохондрий на биологические свойства, такие как клеточный метаболизм, пластичность, пролиферации и реакции на терапию.
Introduction
Митохондрии являются органеллы, найденные в эукариотических клетках, где они играют центральную роль в поглощении питательных веществ, а также в производстве энергии и метаболита. Эти органеллы содержат круговой митохондриальной ДНК (мтДНК), длиной 16.6 кб, который кодирует белки цепных комплексов электронного транспорта, тРНК и рРНК 1. Функциональность этих органелл имеет решающее значение для клеточного гомеостаза и несколько патологиями, были связаны с митохондриальной дисфункцией 1, 2, 3. Статус митохондрии было, например, связан с воспалением, инфекционных заболеваний и рака, в этом последнем случае , с последствиями для метастазирование и устойчивость к терапии 4, 5, 6, 7.
Митохондрии отобразить замечательную способность получение передаваемых между «донора» и «целевых» клеток. Это приводит к изменениям в энергетическом метаболизме клеток – мишеней, а также в других функциональных модификаций , таких как восстановление ткани и устойчивость к химиотерапевтическим средствам, как недавно показано разных лабораториях 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (МСК) , отображать эту способность переносить митохондрии в самых разнообразных клеток – мишеней, в том числе кардиомиоцитов, эндотелиальные клетки, легочные гиперплазии эпителиальных клеток, клетки почечных канальцев и раковых клеток, что приводит к модификации функциональных свойств этих клеток 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
обмен Митохондрии теперь появляется как широко используемый механизм, который позволяет несколько различных типов клеток, чтобы общаться друг с другом и изменять свои биологические свойства. Этот обмен митохондрии может происходить через формирование туннельного Нанотрубки (ТНТ), с участием коннексина 43-содержащих щелевые контакты 8 или M-Sec / TNFaip2 и экзоцисты комплекс 19. В качестве альтернативы, передача Митохондрии также было показано, опосредовано arrestin домен-содержащих белок 1-опосредованных микровезикулы (ARMMs) 20. Интересно отметить , что эффективность передачи митохондрии была связана со скоростью экспрессии Rho ГТФ 1 MIRO1 21, что является ключевым фактором для объяснения различий в эффективностей передачи митохондрии между iPSC-MSCs и взрослых БМ-22 MSCs.
Несмотря на это богатство данных, касающихся клетки к клетке обмена митохондрии, относительно мало известно о метаболических и биологического исхода этого переноса митохондрии. Таким образом, она полностью гарантирует создание соответствующих инструментов, чтобы в полной мере оценить биологические эффекты этого переноса. На протяжении многих лет несколько технических подходов к передаче митохондрии от донора к акцепторной клеток, были предложены. Это включает в себя прямое впрыскивание митохондрий в ооцитах 23, 24, 25, слияние клеток генерировать transmitochondrial цибридами 26, 27 и, совсем недавно, передача изолированных митохондрий с использованием фототермическая nanoblades 28.
Мы и другие ранее продемонстрировали способность изолированной mitochondRIA быть усвоены живыми клетками, как это наблюдается как в пробирке и в естественных условиях 29, 30, 31, через механизмы предложил привлечь макропиноцитозом 32. Мы разработали далее метод, называемый MitoCeption, чтобы количественно перенесите изолированными митохондриями (от ПКЦ) в клетки – мишени, в качестве примера с (приверженец) MDA-MB-231 клеток рака молочной железы линии 31. Этот протокол был адаптирован здесь для передачи изолированных митохондрий MSC человека к глиобластомы стволовых клеток (GSCs).
Глиобластома агрессивные злокачественные опухоли головного мозга , которые быстро становятся устойчивыми к лечению, в основном за счет стволовых клеток глиобластомы (ГСС) , присутствующих в опухоли 33. Эти GSCs растут как нейросферах в пробирке и генерировать опухоли в ксенотрансплантатных моделях. Раковые клетки в пределах глиобластомы имеютспособность принимать соединения от клетки к клетке, как показано в последнее время для астроцитарных клеток опухоли головного мозга , которые , через которые митохондрии (а также ядер кальция и клеток) могут мигрировать межсоединений с помощью расширенных микропробирок,, в результате лучевой терапии устойчивых к астроцитомой сетей 34. Глиобластомы может набрать много различных клеток в опухоли микроокружения, в том числе ПКЦ 35, 36. Мы показали, что MSCs может сделать соединения межклеточные с GSCs в сокультивирования и передавать свои митохондрии (данные не показаны), которые, как ожидается, чтобы изменить GSC функциональные свойства. Настоящий протокол описывает, как метод MitoCeption может быть использован для передачи митохондрии, выделенные предварительно из человеческих MSCs, человеческих GSCs с целью определения их функционального биологического результата. Мультипотентны и высоко онкогенные GB4 GSC линия 37 была использована в данном исследовании.
Protocol
Representative Results
Discussion
Все большее число исследований показывают, что клетки могут обмениваться митохондрии и что эти митохондрии оказывают глубокое воздействие на метаболизм и функции клеток-мишеней. Поэтому крайне важно освоить инструменты, чтобы количественно перенести митохондрии от донора клеток в э…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Андреа Parmeggiani (L2C и DIMNP, Монпелье), Бенуа Шарло (IES, Монпелье), а также члены лаборатории за полезные обсуждения, Кристоф Duperray за помощь при проведении анализа FACS, Монпелье объекта РИО томография (МРТ) для предоставления адекватная среда для FACS и конфокальной микроскопии. БНМ была поддержана в аспирантуре от Labex Numev (Конвенция ANR-10-LabX-20). AB была поддержана бакалавриате общения с Варшавским университетом и Европейским Союзом (№ POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV является научный сотрудник из Национального центра научных исследований (CNRS).
Materials
| Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
| N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
| B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
| HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
| poly Heme | Sigma | P3932 |
| aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
| DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
| Glucose | Sigma | G7021 |
| Insuline | Sigma | I 1882 |
| Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
| Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| CaCl2 | MERCK | 2382 |
| Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
| DNase I | SIGMA | 10104159001 |
| Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 |
| Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
| Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
| Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
| Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
| Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
| MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
| MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
| MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
| CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
| CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
| RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
| FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
| FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
| FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
| LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |
References
- Vafai, S. B., Mootha, V. K. Mitochondrial disorders as windows into an ancient organelle. Nature. 491 (7424), 374-383 (2012).
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Chandel, N. S. Mitochondria as signaling organelles. BMC Biol. 12 (1), 34 (2014).
- Schulze, A., Harris, A. L. How cancer metabolism is tuned for proliferation and vulnerable to disruption. Nature. 491 (7424), 364-373 (2012).
- Peiris-Pages, M., Martinez-Outschoorn, U. E., Pestell, R. G., Sotgia, F., Lisanti, M. P. Cancer stem cell metabolism. Breast Cancer Res. 18 (1), 55 (2016).
- LeBleu, V. S., et al. PGC-1alpha mediates mitochondrial biogenesis and oxidative phosphorylation in cancer cells to promote metastasis. Nat Cell Biol. 16 (10), 992-1003 (2014).
- Liu, S., Feng, M., Guan, W. Mitochondrial DNA sensing by STING signaling participates in inflammation, cancer and beyond. Int J Cancer. 139 (4), 736-741 (2016).
- Islam, M. N., et al. Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med. 18 (5), 759-765 (2012).
- Pasquier, J., et al. Preferential transfer of mitochondria from endothelial to cancer cells through tunneling nanotubes modulates chemoresistance. J Transl Med. 11, 94 (2013).
- Plotnikov, E. Y., Khryapenkova, T. G., Galkina, S. I., Sukhikh, G. T., Zorov, D. B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. Exp Cell Res. 316 (15), 2447-2455 (2010).
- Spees, J. L., Olson, S. D., Whitney, M. J., Prockop, D. J. Mitochondrial transfer between cells can rescue aerobic respiration. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1283-1288 (2006).
- Liu, K., et al. Mesenchymal stem cells rescue injured endothelial cells in an in vitro ischemia-reperfusion model via tunneling nanotube like structure-mediated mitochondrial transfer. Microvasc Res. 92, 10-18 (2014).
- Bukoreshtliev, N. V., et al. Selective block of tunneling nanotube (TNT) formation inhibits intercellular organelle transfer between PC12 cells. FEBS Lett. 583 (9), 1481-1488 (2009).
- Gurke, S., et al. Tunneling nanotube (TNT)-like structures facilitate a constitutive, actomyosin-dependent exchange of endocytic organelles between normal rat kidney cells. Exp Cell Res. 314 (20), 3669-3683 (2008).
- Vallabhaneni, K. C., Haller, H., Dumler, I. Vascular smooth muscle cells initiate proliferation of mesenchymal stem cells by mitochondrial transfer via tunneling nanotubes. Stem Cells Dev. 21 (17), 3104-3113 (2012).
- Wang, X., Gerdes, H. H. Transfer of mitochondria via tunneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells. Cell Death Differ. 22 (7), 1181-1191 (2015).
- Plotnikov, E. Y., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. J Cell Mol Med. 12 (5A), 1622-1631 (2008).
- Acquistapace, A., et al. Human mesenchymal stem cells reprogram adult cardiomyocytes toward a progenitor-like state through partial cell fusion and mitochondria transfer. Stem Cells. 29 (5), 812-824 (2011).
- Hase, K., et al. M-Sec promotes membrane nanotube formation by interacting with Ral and the exocyst complex. Nat Cell Biol. 11 (12), 1427-1432 (2009).
- Phinney, D. G., et al. Mesenchymal stem cells use extracellular vesicles to outsource mitophagy and shuttle microRNAs. Nat Commun. 6, 8472 (2015).
- Ahmad, T., et al. Miro1 regulates intercellular mitochondrial transport & enhances mesenchymal stem cell rescue efficacy. Embo J. 33 (9), 994-1010 (2014).
- Zhang, Y., et al. iPSC-MSCs with High Intrinsic MIRO1 and Sensitivity to TNF-a Yield Efficacious Mitochondrial Transfer to Rescue Anthracycline-Induced Cardiomyopathy. Stem Cell Reports. 7 (4), 749-763 (2016).
- Takeda, K., et al. Influence of intergeneric/interspecies mitochondrial injection; parthenogenetic development of bovine oocytes after injection of mitochondria derived from somatic cells. J Reprod Dev. 58 (3), 323-329 (2012).
- Takeda, K., et al. Microinjection of cytoplasm or mitochondria derived from somatic cells affects parthenogenetic development of murine oocytes. Biol Reprod. 72 (6), 1397-1404 (2005).
- Van Blerkom, J., Sinclair, J., Davis, P. Mitochondrial transfer between oocytes: potential applications of mitochondrial donation and the issue of heteroplasmy. Hum Reprod. 13 (10), 2857-2868 (1998).
- Ishikawa, K., et al. ROS-generating mitochondrial DNA mutations can regulate tumor cell metastasis. Science. 320 (5876), 661-664 (2008).
- Kaipparettu, B. A., Ma, Y., Wong, L. J. Functional effects of cancer mitochondria on energy metabolism and tumorigenesis: utility of transmitochondrial cybrids. Ann N Y Acad Sci. 1201, 137-146 (2010).
- Wu, T. H., et al. Mitochondrial Transfer by Photothermal Nanoblade Restores Metabolite Profile in Mammalian Cells. Cell Metab. 23 (5), 921-929 (2016).
- Masuzawa, A., et al. Transplantation of autologously derived mitochondria protects the heart from ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (7), H966-H982 (2013).
- Kitani, T., et al. Direct human mitochondrial transfer: a novel concept based on the endosymbiotic theory. Transplant Proc. 46 (4), 1233-1236 (2014).
- Caicedo, A., et al. MitoCeption as a new tool to assess the effects of mesenchymal stem/stromal cell mitochondria on cancer cell metabolism and function. Sci Rep. 5, 9073 (2015).
- Kesner, E. E., Saada-Reich, A., Lorberboum-Galski, H. Characteristics of Mitochondrial Transformation into Human Cells. Sci Rep. 6, 26057 (2016).
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Osswald, M., et al. Brain tumour cells interconnect to a functional and resistant network. Nature. 528 (7580), 93-98 (2015).
- Shinojima, N., et al. TGF-beta mediates homing of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells to glioma stem cells. Cancer Res. 73 (7), 2333-2344 (2013).
- Velpula, K. K., Dasari, V. R., Rao, J. S. The homing of human cord blood stem cells to sites of inflammation: unfolding mysteries of a novel therapeutic paradigm for glioblastoma multiforme. Cell Cycle. 11 (12), 2303-2313 (2012).
- Guichet, P. O., et al. Cell death and neuronal differentiation of glioblastoma stem-like cells induced by neurogenic transcription factors. Glia. 61 (2), 225-239 (2013).
- Lyons, E. A., Scheible, M. K., Sturk-Andreaggi, K., Irwin, J. A., Just, R. S. A high-throughput Sanger strategy for human mitochondrial genome sequencing. BMC Genomics. 14, 881 (2013).
