Här, är ett protokoll (MitoCeption) presenteras för att överföra mitokondrier, isolerade från humana mesenkymala stamceller (MSC), till glioblastom stamceller (GSC), med målet att studera deras biologiska effekter på GSC metabolism och funktioner. Ett liknande protokoll kan anpassas för att överföra mitokondrier mellan andra celltyper.
Mitokondrierna spelar en central roll för cellmetabolism, energiproduktion och kontroll av apoptos. Otillräcklig mitokondriefunktion har befunnits ansvarig för mycket olika sjukdomar, som sträcker sig från neurologiska sjukdomar till cancer. Intressant nog har mitokondrier nyligen visats att visa förmåga att överföras mellan celltyper, särskilt från humana mesenkymala stamceller (MSC) till cancerceller i samodling förhållanden, med metabola och funktionella konsekvenser för mitokondrier mottagarceller, att ytterligare stärka den aktuella för de biologiska egenskaperna hos dessa organeller.
Utvärdera effekterna av den överförda MSC mitokondrier i målceller är av största vikt att förstå den biologiska resultatet av sådana cell-cell interaktioner. Den MitoCeption protokoll som beskrivs här tillåter överföring av mitokondrierna isolerade i förväg från givarceller till målcellerna med hjälp av MSC mitokondrieroch glioblastom stamceller (GSC) som ett modellsystem. Detta protokoll har tidigare använts för att överföra mitokondrier, isolerade från MSC: er, för att vidhäftande MDA-MB-231 cancerceller. Detta mitokondrierna överföringsprotokoll anpassas här för GSCs som presenterar den specifika egenhet att växa som neuro in vitro. Överföringen av isolerade mitokondrier kan följas av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och konfokal avbildning med mitokondrier vitala färgämnen. Användningen av mitokondrier donator- och målceller med distinkta haplotyper (SNP) möjliggör också detektering av de överförda mitokondrier, baserat på koncentrationen av deras cirkulära mitokondrie-DNA (mtDNA) i målcellerna. När protokollet har validerats med dessa kriterier, kan cellerna hyser de överförda mitokondrier analyseras ytterligare för att bestämma effekterna av exogena mitokondrier på biologiska egenskaper såsom cellmetabolism, plasticitet, spridning och behandlingssvaret.
Mitokondrierna är organeller som finns i eukaryota celler där de spelar en central roll i näringsupptag samt energi och metabolit produktion. Dessa organeller innehåller cirkulär mitokondrie-DNA (mtDNA), 16,6 kb långt, som kodar för proteiner av elektrontransportkedjan komplex, tRNA och rRNA 1. Funktionaliteten hos dessa organeller är avgörande för cell homeostas och flera patologier har förknippats med mitokondrier dysfunktion 1, 2, 3. Mitokondrierna status har till exempel varit kopplade till inflammation, infektionssjukdomar och cancer, i det senare fallet med konsekvenser för metastaser och resistens mot behandling 4, 5, 6, 7.
Mitokondrier visar anmärkningsvärd kapacitet få överföras mellan "givare" och "mål" celler. Detta leder till förändringar i den energiska metabolism av målcellerna såväl som i andra funktionella modifieringar såsom vävnadsreparation och motstånd mot kemoterapeutiska medel, vilket har framgått av olika laboratorier 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16. De humana mesenkymala stamceller (MSC) för att visa denna förmåga att överföra mitokondrier till en bred variation av målceller, inklusive hjärtmuskelceller, endotelceller pulmonära alveolära epitelceller, renala tubulära celler och cancerceller, vilket leder till modifieringar av de funktionella egenskaperna hos dessa celler 8,> 9, 10, 12, 17, 18.
Mitokondrier utbyte verkar nu som en brett använd mekanism som medger ett antal olika celltyper för att kommunicera med varandra och ändra deras biologiska egenskaper. Denna mitokondrier utbyte kan ske genom tunnel nanorör (TNT) bildning som omfattar connexin 43-innehållande gap junctions 8 eller M-Sec / TNFaip2 och exocyst komplexa 19. Alternativt framställdes mitokondrierna överföringen också visat sig vara medierad av arrestin domän-innehållande protein 1-medierade mikrovesiklar (ARMMs) 20. Intressant nog var effekten av mitokondrierna överföringen i samband med uttrycket hastigheten av Rho GTPas en MIRO1 21, en nyckelfaktor för att förklara skillnaderna i mitokondrier överföringsutbyte mellan iPSC-MSC och vuxna BM-MSC 22.
Trots denna rikedom av uppgifter om cell till cell mitokondrier utbyte, är relativt lite känt om den metaboliska och biologiska resultatet av denna mitokondrier överföring. Därför helt motiverar det inrätta lämpliga verktyg för att helt utvärdera de biologiska effekterna av denna överföring. Under årens lopp har flera tekniska metoder överföra mitokondrier från donator till acceptor celler har föreslagits. Detta inkluderar direkt injektion av mitokondrier i oocyter 23, 24, 25, cellfusion för att generera transmitochondrial Cybrids 26, 27 och, mer nyligen, överföring av isolerade mitokondrier med hjälp av fototermiska nanoblades 28.
Vi och andra tidigare visat förmåga isolerade mitochondria som skall internaliseras av levande celler, såsom observerats både in vitro och in vivo 29, 30, 31, genom mekanismer som föreslås för att involvera macropinocytosis 32. Vi utvecklade vidare en metod, som kallas MitoCeption, kvantitativt överföra isolerade mitokondrier (från MSC: er) till målceller, såsom exemplifieras med (den vidhäftande) MDA-MB-231 bröstcancercell-linjen 31. Detta protokoll anpassades här för överföring av isolerade humana MSC mitokondrier till glioblastom stamceller (GSCs).
Glioblastom är aggressiva maligna tumörer i hjärnan som snabbt blir resistenta mot behandling, främst till följd av glioblastom stamceller (GSC) förekommer i tumören 33. Dessa GSCs växa som neuro in vitro och generera tumörer i xenograft-modeller. Cancerceller inom glioblastom harförmåga att göra cell-till-cell-anslutningar, som visas nyligen astrocytiska hjärntumörceller som interconnect via utökade mikrorör, genom vilken mitokondrier (liksom kalcium och cellkärnor) kan migrera, vilket resulterar i strålbehandling resistenta astrocytom nätverk 34. Glioblastoma kan rekrytera många olika celler i tumören mikro, inklusive MSC 35, 36. Vi visade att MSC kan göra cell-cell kontakter med GSCs i samodling och överföra sina mitokondrier (data visas ej), som förväntas modifiera GSC funktionella egenskaper. Det nuvarande protokollet beskriver hur MitoCeption teknik kan användas för att överföra mitokondrier, isolerade i förväg från humana MSC, mänskliga GSCs i syfte att fastställa deras funktionella biologiska resultat. Den multipotenta och mycket tumorigena GB4 GSC linje 37 användes i denna studie.
Ett ökande antal studier visar att celler kan utbyta mitokondrier och att dessa mitokondrier har djupgående effekter på målet cellens ämnesomsättning och funktioner. Därför är det nödvändigt att behärska de verktyg för att kvantitativt överföra mitokondrier från donatorcellerna på dessa målceller för att möjliggöra en noggrann studie av deras biologiska effekter.
Protokollet som beskrivs här var ursprungligen räknat ut för att överföra mitokondrier isolerade från h…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Andrea Parmeggiani (L2C och DIMNP, Montpellier), Benoit Charlot (IES, Montpellier) samt medlemmar av laboratoriet för bra diskussioner, Christophe Duperray för hjälp med FACS-analys, Montpellier RIO imaging anläggning (MRI) för att tillhandahålla lämplig miljö för FACS och konfokalmikroskopi. BNM stöddes av en examen stipendium från LABEX Numev (konvention ANR-10-LABX-20). AB stöddes av en grund stipendium från universitetet i Warszawa och Europeiska unionen (nr POKL.04.01.02-00-221 / 12). MLV är en personal forskare från National Center för vetenskaplig forskning (CNRS).
Mitochondria Isolation Kit for Tissue | Fisher Scientific | 10579663 |
N-2 Supplement (100X) | Fisher Scientific | 11520536 |
B-27 Supplement W/O VIT A (50X) | Fisher Scientific | 11500446 |
HBSS w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Sigma | H4385 |
poly Heme | Sigma | P3932 |
aMEM w/o glutamine | Ozyme | BE12-169F |
DMEM/F-12 without glutamine, | Fisher Scientific | 11540566 |
L-Glutamine | Invitrogen | 25030-024 |
Glucose | Sigma | G7021 |
Insuline | Sigma | I 1882 |
Human bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 |
Human EGF | Peprotech | AF-100-15 |
Heparin | Sigma | H3149 |
CaCl2 | MERCK | 2382 |
Trypsine Inhibitor | Sigma | T9003 |
DNase I | SIGMA | 10104159001 |
Trypsine 0.25% /EDTA 1 mM | Invitrogen | 25200056 |
Trypsin | Gibco | 15090-046 |
Protease inhibitors EDTA free | Sigma | 4693159001 |
Ciprofloxacine | Sigma | 17850-5G-F |
Fungine | Invivogen | ant-fn-1 |
Fungizone | Thermofisher | 15290018 |
Gentamycin | Euromedex | EU0410 |
MitoTracker Green FM | Molecular Probes | M7514 |
MitoTracker Red CMXRos | Molecular Probes | M7512 |
MitoTracker Deep Red FM | Molecular Probes | M22426 |
CellTracker Green CMFDA | Molecular Probes | C7025 |
CellTracker Blue CMF2HC | Molecular Probes | C12881 |
RIPA | Santa Cruz | sc-24948 |
FluoroDish Sterile Culture Dish | World Precision Instruments | FD35-100 |
Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 |
FACS tubes | Beckman Coulter | 2,523,749 |
FACS apparatus | Gallios | 3L 10C |
LC FAST START DNA MASTER PLUS | Roche | 3515885001 |