Summary

Multímero-PAGE: Un método para capturar y Proteína Resolver Complejos en muestras biológicas

Published: May 05, 2017
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Summary

Un método para estabilizar y separar los complejos de proteínas nativas de lisado de tejido no modificado utilizando un proteína reticulante reactivo con amina acoplada a una novela de dos dimensiones electroforesis en gel de poliacrilamida se presenta sistema (PAGE).

Abstract

Hay muchos métodos bien desarrollados para la purificación y el estudio de proteínas individuales y péptidos. Sin embargo, la mayoría de las funciones celulares se llevan a cabo por las redes de interacción complejos de proteínas, que son a menudo difíciles de investigar debido a que su unión es no covalente y fácilmente perturbado por técnicas de purificación. Este trabajo describe un método de estabilización y separación de los complejos de proteínas nativas a partir de tejido no modificado usando electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tejido se carga en un gel de poliacrilamida azul-nativo no desnaturalizante, a continuación, se aplica una corriente eléctrica hasta que la proteína migra una corta distancia en el gel. La tira de gel que contiene la proteína migrado después se escinde y se incubó con los ditiobis de amina reactiva reticulantes reactivos (succinimidil propionato), que estabiliza covalentemente complejos de proteínas. La tira de gel que contiene complejos reticulados se moldea a continuación en un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, y tél complejos se separan por completo. El método se basa en técnicas y materiales familiares para la mayoría de los biólogos moleculares, lo que significa que es barato y fácil de aprender. A pesar de que está limitado en su capacidad para separar adecuadamente los complejos extremadamente grandes, y no ha sido universalmente exitosa, el método fue capaz de capturar una amplia variedad de complejos bien estudiados, y es probable aplicable a muchos sistemas de interés.

Introduction

La función celular normal depende de interacciones proteína-proteína 1, 2. Como resultado, las enfermedades humanas son a menudo marcadas por las perturbaciones en el montaje y comportamiento de varios complejos de proteínas 3. La capacidad de caracterizar tales interacciones es por lo tanto crítico. medios actuales de detección de estas interacciones requieren la purificación de proteínas diana, a menudo seguidas por desplegable de sus socios que interactúan. Convencionales de purificación se lleva a cabo por centrifugación diferencial, precipitación y / o cromatografía 4. Estos métodos son mucho tiempo, deben ser alterados para cada proteína diana, y a menudo resultan en bajos rendimientos. Métodos de purificación modernos implican la fusión de etiquetas peptídicas a proteínas diana, seguido por inmunoprecipitación o extracción en columnas cargadas con perlas unidas a una molécula de captura 5,"> 6. Si bien esto es extensible a muchas proteínas, se requiere modificación de la secuencia de la diana, potencialmente resultando en construcciones que difieren en afinidad por sus parejas de unión habituales. La delicada naturaleza de algunas interacciones proteína-proteína significa este método puede no ser aplicable a muchos escenarios. Además, las pull-down ensayos usados ​​para mapear las interacciones proteína-proteína pueden no capturar una imagen precisa celular, debido a los grados de libertad restringidos y los niveles no nativos de la proteína cebo.

Idealmente, los complejos de proteínas podrían ser detectados en sus estados nativos, sin la necesidad de purificación o pull-down. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE) se desarrolló como una alternativa menos desnaturalizante a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), y permite la separación de algunas proteínas y complejos de muestras biológicas 7. Sin embargo, las proteínas en BN-PAGE separado basado en un larnúmero ge de variables, incluyendo el tamaño, carga, estructura tridimensional, y la asociación con otras moléculas. Las interacciones de estos factores a menudo resultan en co-separación de proteínas, la formación de agregados, y una pobre resolución banda de proteína. Electroforesis en gel de poliacrilamida nativo de dos dimensiones resuelve algunos, pero no todos, de estos problemas 8.

Para evitar las complicaciones asociadas con la separación nativa, algunos autores utilizan reactivos de amina reactiva de reticulación, tales como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar complejos de proteínas en lisados de tejido 4. Estos lisados ​​tratados a continuación, se pueden desnaturalizar y se separaron por SDS-PAGE, mientras que preserva el tamaño nativo y maquillaje de complejos de proteínas. Sin embargo, ya que los reactivos de reticulación reaccionan basa en la proximidad de una molécula a otra, y las proteínas en los lisados ​​de tejido tienen muchos grados de libertad y estocásticamente puede interactuar, cruz fondo no específica-linking puede ser alto, especialmente en muestras concentradas. Esto puede conducir a resultados difíciles de interpretar.

Aquí, demostramos el uso de un método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominado electroforesis en gel de poliacrilamida-multímero (multímero-PAGE), para separar y detectar los conjuntos de proteínas en mezclas complejas. Inicialmente, lisado de células se suspende en gel de poliacrilamida a través de BN-PAGE. El gel que contiene lisado se hace reaccionar luego con el DSP reactivo de reticulación. Pseudo-inmovilizado y ligeramente separadas en el gel, las proteínas son mucho menos propensos a reaccionar de manera no específica, lo que significa reactividad fondo reticulante se reduce. Después de la reticulación, las bandas de gel se extirpan y se separó a través de SDS-PAGE. El gel resultante se puede analizar entonces por cualquier medio típicamente asociados con electroforesis en gel de poliacrilamida. Este método permite la separación y la detección de complejos de proteínas nativas en lisado de tejido sin modificar, sin la necesidad de purificación adicional o pull-downorte.

Protocol

1. Preparación del tejido Preparar 10 ml de 4x tampón de muestra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) amino-tris (hidroximetil) metano (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ). NOTA: Esta solución madre se puede hacer de antemano y se almacena a 4 ° C. Diluir 250! L de tampón de muestra 4x en 750! L dH 2 O que contiene 1x cóctel inhibidor de proteasa comercial. Vortex y se enfría en hielo. Homogeneizar 20 mg de tejido diana en el 1 …

Representative Results

En este experimento de demostración, multímero-PAGE se realizó en toda lisado de cerebro de rata. Las proteínas resultantes separados se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF), y después se sondaron con anticuerpos contra las proteínas que se sabe que forman complejos. La figura 1 muestra una validación del protocolo por dos medios. En primer lugar, se demuestra que las proteínas reticuladas son escindibles mediante la adición de un age…

Discussion

interacciones proteína-proteína son importantes para cada tarea de los seres vivos llevan a cabo. Debido a esto, son objeto de un intenso escrutinio y la investigación. Multímero-página es un nuevo método para capturar, separar, y el análisis de una amplia gama de complejos de proteínas. Hemos demostrado anteriormente su aplicabilidad al estudio de oligimerization de la proteína α-sinucleína asociada a la enfermedad 11. Sin embargo, es extensible a muchos complejos de proteínas, como …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Con el apoyo de la DA034783 NIH / NIDA. Agradecemos a Bryan A. Killinger para la asistencia técnica con el multímero-página.

Materials

Chemicals
ε-Aminocaproic acid Sigma A2504
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic.
Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) BioRad 161-0148 Toxic.
Ammonium persulfate Sigma A3678
Anti rabbit IgG-HRP from goat Santa Cruz Biotechnology sc-2004
Bicinchoninic acid assay kit Thermofisher 23225
Bis-tris Sigma B9754
Bovine serum albumin Sigma A9647
Butanol Fisher Scientific A399-1
Chemiluminescence substrate kit ThermoFisher 24078
Coomassie blue G-250 Sigma-Aldrich B0770
Digitonin Sigma D141 Toxic.
Dimethyl sulfoxide Fisher Scientific D128-1
Dithiobis(succinimidylpropionate) Thermo Scientific 22585
Dry nonfat milk LabScientific M0841
Glycerol Sigma G9012
Glycine Fisher Scientific BP381-5
Halt Protease Inhibitor Cocktail Thermofisher 78430
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144SI-212 For titration. Caustic.
Methanol Fisher Scientific A412-4 For PVDF membrane activation. Toxic.
Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit Santa Cruz Biotechnology sc-7011-R
N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Sigma T9281
N,N'-methylenebisacrylamide Acros Organics 16479 Toxic.
NP40 Boston Bioproducts P-872
Polysorbate 20 (tween-20) Fisher Scientific BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes Thermo Scientific 88518
Ponceau S Sigma P3504
Potassium chloride Fisher Scientific P217-3
Potassium phosphate monobasic Sigma P9791
Protease inhibitor cocktail Thermo Scientific 88265
SDS solution (10% w/v) BioRad 161-0416
Sodium chloride Fisher Scientific BP358-212
Sodium dodecyl sulfate Sigma L37771
Sodium phosphate monobasic Fisher Scientific BP329-1
Tricine Sigma T0377
Tris base Fisher Scientific BP152-500
Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) BioRad 161-0799
Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) BioRad 161-0798
Name Company Catalog Number Comments
Instruments
GE Imagequant LAS 4000 GE Healthcare 28-9558-10
ImageJ software NIH
Synergy H1 microplate reader BioTek
Gel Former + Stand Biorad
Microfuge 22R centrifuge Beckman Coulter
2 mL dounce homogenizer
Vortex mixer Fisher Scientific
Ultrasonic tissue homogenizer Fisher Scientific FB120220

References

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Citer Cet Article
Rhinesmith, T., Killinger, B. A., Sharma, A., Moszczynska, A. Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples. J. Vis. Exp. (123), e55341, doi:10.3791/55341 (2017).

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