Multimer-पृष्ठ: जैविक नमूने में संगृहीत करने के लिए विधि और समाधान करना प्रोटीन परिसरों
Summary
स्थिर और एक अमाइन-रिएक्टिव प्रोटीन पार लिंकर एक उपन्यास दो आयामी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए युग्मित का उपयोग कर असंशोधित ऊतक lysate से देशी प्रोटीन परिसरों को अलग करने के लिए एक विधि (पृष्ठ) प्रणाली प्रस्तुत किया है।
Abstract
वहाँ शुद्ध और एकल प्रोटीन और पेप्टाइड्स के अध्ययन के लिए कई अच्छी तरह से विकसित तरीके हैं। हालांकि, सबसे सेलुलर कार्यों बातचीत प्रोटीन परिसरों का नेटवर्क है, जो अक्सर जांच के लिए अपने बाध्यकारी क्योंकि गैर सहसंयोजक और आसानी से शोधन तकनीक से परेशान है मुश्किल हो जाता है के द्वारा किया जाता है। इस काम को स्थिर करने और दो आयामी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर असंशोधित ऊतकों से देशी प्रोटीन परिसरों को अलग करने की एक विधि का वर्णन है। ऊतक lysate एक गैर denaturing नीली देशी पॉलीएक्रिलमाइड जेल पर लोड किया जाता है, तो एक विद्युत प्रवाह जब तक प्रोटीन जेल में कुछ ही दूरी पर माइग्रेट करती लागू किया जाता है। जेल माइग्रेट प्रोटीन युक्त पट्टी तो excised और एमाइन प्रतिक्रियाशील पार जोड़ने अभिकर्मक dithiobis (succinimidyl प्रोपियोनेट) है, जो सहसंयोजक प्रोटीन परिसरों स्थिर साथ इनक्यूबेट है। जेल पार से जुड़े परिसरों युक्त पट्टी फिर एक सोडियम dodecyl सल्फेट पॉलीएक्रिलमाइड जेल में डाला जाता है, और टीवह परिसरों पूरी तरह से अलग होती है। विधि तकनीक और सबसे आण्विक जीव विज्ञानियों के लिए परिचित सामग्री पर निर्भर करता है, जिसका अर्थ यह सस्ती और जानने के लिए आसान है। यह पर्याप्त रूप से बहुत बड़ी परिसरों को अलग करने की क्षमता में सीमित है, और सार्वभौमिक सफल नहीं किया गया है, वहीं विधि अच्छी तरह से अध्ययन किया परिसरों की एक विस्तृत विविधता पर कब्जा करने में सक्षम था, और संभावना ब्याज की कई प्रणालियों के लिए लागू है।
Introduction
सामान्य सेलुलर समारोह प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया 1, 2 पर निर्भर है। नतीजतन, मानव रोगों अक्सर विधानसभा और विभिन्न प्रोटीन परिसरों 3 के व्यवहार में अव्यवस्थाएं द्वारा चिह्नित हैं। इस तरह बातचीत को चिह्नित करने की क्षमता इसलिए महत्वपूर्ण है। इन मुलाकातों का पता लगाने के वर्तमान साधन लक्ष्य प्रोटीन, अक्सर उनके बातचीत भागीदारों की पुल-डाउन के बाद की शुद्धि की आवश्यकता है। पारंपरिक शोधन अंतर centrifugation, वर्षा, और / या क्रोमैटोग्राफी 4 द्वारा पूरा किया है। इन विधियों, समय लेने वाली हैं प्रत्येक लक्ष्य प्रोटीन के लिए बदल दिया जाना चाहिए, और अक्सर कम पैदावार में परिणाम। आधुनिक शुद्धि के तरीकों, एक पर कब्जा अणु 5 के लिए बाध्य मोती के साथ भरी हुई स्तंभों पर पेप्टाइड टैग की संलयन प्रोटीन लक्षित करने के लिए, प्रतिरक्षक अवक्षेपण या निकासी के बाद शामिल"> 6। हालांकि यह कई प्रोटीन के एक्स्टेंसिबल है, यह लक्ष्य के अनुक्रम संशोधन की आवश्यकता है, संभवतः निर्माणों कि अपने सामान्य बाध्यकारी भागीदारों के लिए आत्मीयता में अलग हो जाती है। कुछ प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया के नाजुक प्रकृति का मतलब है इस विधि लागू नहीं किया जा सकता कई स्थितियों के लिए। इसके अतिरिक्त, पुल-डाउन प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया मैप करने के लिए इस्तेमाल किया assays एक सटीक सेलुलर चित्र स्वतंत्रता और चारा प्रोटीन की गैर देशी स्तरों में से प्रतिबंधित डिग्री की वजह से कैप्चर नहीं कर सकते,।
आदर्श रूप में, प्रोटीन परिसरों, उनके मूल राज्यों में पता लगाया जा सकता है शुद्धि या पुल-डाउन की आवश्यकता के बिना। ब्लू देशी पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (बी एन-पृष्ठ) सोडियम dodecyl सल्फेट पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) के लिए एक कम denaturing विकल्प के रूप में विकसित की है, और जैविक नमूनों 7 से कुछ प्रोटीन और परिसरों में से अलग होने के लिए अनुमति देता है किया गया था। हालांकि, बी एन-पृष्ठ में प्रोटीन एक lar के आधार पर अलगआकार, प्रभारी, तीन आयामी संरचना, और संघ अन्य अणुओं के साथ सहित चर, की जीई संख्या। इन कारकों में से बातचीत अक्सर प्रोटीन की सह-जुदाई, कुल गठन, और गरीब प्रोटीन बैंड संकल्प में परिणाम। दो आयामी देशी-पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन इन समस्याओं को 8 में से कुछ का समाधान करता है, लेकिन सभी नहीं,।
देशी जुदाई से संबंधित जटिलताओं को नाकाम करने के लिए, कुछ लेखकों ऐसे dithiobis (succinimidyl प्रोपियोनेट) के रूप में एमाइन प्रतिक्रियाशील पार जोड़ने अभिकर्मकों, (डीएसपी), का उपयोग ऊतक lysates 4 में प्रोटीन परिसरों पर कब्जा करने की। ये इलाज किया lysates तो विकृत और, एसडीएस-पृष्ठ से अलग कर दिया, जबकि देशी आकार और प्रोटीन परिसरों का मेकअप संरक्षण किया जा सकता है। हालांकि, बाद से क्रॉस-लिंकिंग अभिकर्मकों और ऊतक lysates में प्रोटीन एक से दूसरे अणु की निकटता के आधार पर प्रतिक्रिया आजादी के कई डिग्री है और प्रसंभात्य बातचीत कर सकते हैं, अविशिष्ट पृष्ठभूमि पार-linking ज्यादा हो सकती है, विशेष रूप से ध्यान केंद्रित किया नमूनों में। यह कठिन व्याख्या परिणाम मिल सकते हैं।
यहाँ, हम एक संकर बी एन-पृष्ठ / एसडीएस-पृष्ठ पद्धति के उपयोग का प्रदर्शन,, multimer-पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (multimer-पृष्ठ) करार दिया अलग और जटिल मिश्रण में प्रोटीन विधानसभाओं पता लगाने के लिए। प्रारंभ में, सेल lysate बी एन-पृष्ठ के माध्यम से पॉलीएक्रिलमाइड जेल में निलंबित कर दिया है। lysate युक्त जेल तो क्रॉस-लिंकिंग अभिकर्मक डीएसपी के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहा है। छद्म स्थिर और थोड़ा जेल जुदा हो गए, प्रोटीन बहुत कम nonspecifically प्रतिक्रिया की संभावना है, जिसका अर्थ है पृष्ठभूमि पार लिंकर प्रतिक्रियात्मकता कम है। क्रॉस-लिंकिंग के बाद, जेल बैंड excised और एसडीएस-पृष्ठ के माध्यम से अलग होती है। उसके एवज में जेल तो आम तौर पर पॉलीएक्रिलमाइड जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ जुड़े किसी भी तरह से विश्लेषण किया जा सकता। इस विधि अतिरिक्त शुद्धि या पुल डो की आवश्यकता के बिना, जुदाई और असंशोधित ऊतक lysate में देशी प्रोटीन परिसरों का पता लगाने के लिए अनुमति देता हैएन।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन प्रोटीन अन्योन्य क्रिया हर काम जीवित चीजों बाहर ले जाने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस वजह से, वे गहन जांच और अनुसंधान के अधीन हैं। Multimer-पेज, पर कब्जा करने को अलग करने, और प्रोटीन परिसरों की एक विस्तृत …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एनआईएच / NIDA DA034783 द्वारा समर्थित। हम multimer-पृष्ठ के साथ तकनीकी सहायता के लिए ब्रायन A किललिंगर धन्यवाद।
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
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