多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法
Summary
新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。
Abstract
単一タンパク質やペプチドを精製し、研究するための多くのよく開発された方法があります。しかし、ほとんどの細胞機能は、それらの結合は、非共有結合および精製技術により、容易に乱されるので、多くの場合、調査が困難であるタンパク質複合体の相互作用のネットワークによって行われます。この作業は、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて修飾されていない組織から天然タンパク質複合体を安定化し、分離する方法を記載しています。組織溶解物は、タンパク質がゲルに短い距離を移動するまで、電流が印加され、非変性ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル上にロードされています。移行されたタンパク質を含むゲルストリップは、次いで、切除し、共有結合タンパク質複合体を安定化アミン反応性架橋試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、と共にインキュベートします。架橋複合体を含有するゲルストリップは、次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにキャストされ、そしてT彼複合体が完全に分離されています。この方法は、それが安価で習得が容易であることを意味、技術と最も分子生物学者になじみの材料に依存しています。それは十分に非常に大きな複合体を分離する能力が制限され、かつ普遍的に成功していないものの、この方法は、十分に研究された複合体の多種多様をキャプチャすることができた、と関心の多くのシステムに可能性が適用されます。
Introduction
正常な細胞機能は、タンパク質-タンパク質相互作用1、2に依存しています。その結果、ヒトの疾患は、しばしば、種々のタンパク質複合体3の組立及び動作の摂動によってマークされます。このような相互作用を特徴付ける能力は極めて重要です。これらの相互作用を検出するための現在の手段は、多くの場合、それらの相互作用パートナーのプルダウンに続いて、標的タンパク質の精製を必要としています。従来の精製は、分画遠心分離、沈殿、及び/又はクロマトグラフィー4によって達成されます。これらの方法は、時間がかかる各標的タンパク質のために変更しなければならない、としばしば低い収率につながります。近代的な精製法は、捕捉分子5に結合されたビーズを搭載したカラム上の免疫沈降または抽出し、タンパク質をターゲットにするペプチドタグの融合を伴いますこれは多くのタンパク質に拡張可能であるが「> 6。、それは潜在的にそれらの通常の結合パートナーに対する親和性の異なる構築物をもたらす、標的の配列の改変を必要とする。いくつかのタンパク質-タンパク質相互作用の微妙な性質は、この方法が適用できない場合があり手段多くのシナリオである。さらに、タンパク質 – タンパク質相互作用をマッピングするために使用されるプルダウンアッセイは、制限された自由度とベイトタンパク質の非天然レベルに起因する正確な細胞画像を、キャプチャしないことができます。
理想的には、タンパク質複合体は、精製またはプルダウンを必要とせず、その天然状態で検出することができました。ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動（BN-PAGE）をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）にあまり変性の代替として開発され、そして生物学的サンプル7からのいくつかのタンパク質との複合体の分離を可能にしました。しかし、BN-PAGE中のタンパク質は、LARに基づいて分離しますサイズ、電荷、立体構造、および他の分子との会合を含む変数のGE番号。これらの要因の相互作用は、多くの場合、タンパク質の同時分離、凝集体形成、および不十分なタンパク質バンドの解像度をもたらします。二次元ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、いくつかを解決し、すべてではないが、これらの問題8の。
天然の分離に関連する合併症を回避するために、何人かの著者は、組織溶解物4のタンパク質複合体を捕捉するために、例えばジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなアミン反応性架橋試薬（DSP）を使用します。これらの治療の溶解物は、変性およびタンパク質複合体の本来のサイズと化粧を維持しながら、SDS-PAGEによって分離することができます。しかしながら、架橋試薬ので、別の分子の近接性に基づいて、および組織溶解物中のタンパク質は、多くの自由度を有し、確率的に相互作用することができ、非特異的バックグラウンドの交差反応特に濃縮したサンプルでは、リンカーが高くなります。これは解釈が難しい結果につながる可能性があります。
ここでは、複合体混合物中のタンパク質集合体を分離および検出するために、マルチマー – ポリアクリルアミドゲル電気泳動（マルチマー-PAGE）と呼ばれるハイブリッドBN-PAGE / SDS-PAGE法の使用を実証する。最初に、細胞溶解物をBN-PAGEを介してポリアクリルアミドゲルに懸濁する。次いで、溶解物含有ゲルを架橋試薬DSPと反応させる。疑似的に固定化され、ゲル上でわずかに分離された場合、タンパク質は非特異的に反応する可能性が低くなり、バックグラウンドの架橋剤の反応性が低下する。架橋後、ゲルバンドを摘出し、SDS-PAGEにより分離する。次いで、得られたゲルを、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に典型的に関連する任意の手段によって分析することができる。この方法は、未精製の組織ライセート中の天然タンパク質複合体の分離および検出を可能にし、追加の精製またはプルダウを必要としないn個。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質間相互作用は、生き物が行っすべてのタスクのために重要です。このため、彼らは厳しい調査と研究の対象となっています。多量-PAGEは、捕捉分離、およびタンパク質複合体の広い範囲を分析するための新規な方法です。我々は以前に疾患関連タンパク質のαシヌクレイン11のoligimerizationを研究への適用可能性を実証しています。しかし、 図2に示され…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH / NIDA DA034783でサポートされています。私たちは、多量-PAGEでの技術支援のためブライアン・A・キリンガー感謝します。
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
