Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri
Summary
stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.
Abstract
arındırıcı ve tek proteinler ve peptidler çalışmak için pek iyi gelişmiş yöntemler vardır. Bununla birlikte, en çok hücresel işlev, sıklıkla, kovalent olmayan ve kolay bir saflaştırma teknikleri ile bozulmuş olan bir bağlanma araştırılması için zor olan etkileşimli protein komplekslerinin ağlar tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, stabilize edici ve iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez ile modifiye edilmemiş dokusundan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem tarif eder. Doku lisatı, protein jel içine kısa bir mesafede yer değiştirmektedir kadar sonra bir elektrik akımı uygulandığında, bir denatüre edici olmayan mavi doğal poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Taşınan protein ihtiva eden jel şeridi daha sonra kesilmiş ve kovalent protein kompleksleri stabilize amin reaktif çapraz bağlama reaktifi ditiobis (sukinimidil propionat) ile inkübe edilir. çapraz bağlı kompleksler ihtiva eden jel şeridi daha sonra bir sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel içine dökülür, ve t,O kompleksleri tamamen ayrılır. yöntem ucuz ve öğrenmesi kolay, yani teknikleri ve en moleküler biyologlar için tanıdık malzemelere dayanır. yeterince aşırı büyük kompleksleri ayırmak için yeteneği sınırlıdır ve evrensel başarılı olmamıştır da, yöntem iyi çalışılmış komplekslerinin çeşitli yakalamak başardı ve ilgi birçok sistemde muhtemelen geçerlidir.
Introduction
Normal hücre fonksiyonlarını protein-protein etkileşimleri, 1, 2 bağlıdır. Bunun bir sonucu olarak, insan hastalıkları genellikle çeşitli protein kompleksleri 3 montajı ve davranış düzensizlik tarafından işaretlenir. Böyle etkileşimleri karakterize yeteneği dolayısıyla çok önemlidir. Bu etkileşimlerin tespit Mevcut araçları genellikle etkileşim ortakları çekme-aşağı ve ardından hedef proteinler, saflaştırılmasını gerektirir. Geleneksel saflaştırma diferansiyel santrifüj, çökeltme ve / veya kromatografi 4 ile gerçekleştirilir. Bu yöntemler zaman alıcıdır, her bir hedef protein için değiştirilmesi gerekir, ve genellikle düşük verimlerle sonuçlanabilir. Modern saflaştırma yöntemleri, bir yakalama molekülü 5 bağlanmış boncuklarıyla yüklenmiş sütunlar üzerinde bağışıklık çökeltmesi ya da ekstre proteinleri hedef peptid etiketleri kaynaşmasını içerenBu, bir çok proteinin şekilde uzatılabilir da "> 6., Potansiyel olarak her zamanki bağlanma partnerleri için afinite açısından farklılık yapılarda ortaya çıkan hedef sekansı, bir modifikasyonunu gerektirir. Bazı protein-protein etkileşimleri, hassas doğası, bu yöntem uygulanabilir olmayabilir demektir birçok senaryolara. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri eşleştirmek için kullanılan açılan tahliller nedeniyle özgürlük ve yem proteinin yerli olmayan seviyelerinin kısıtlı derecelerde, doğru bir hücresel resim toplayamaz.
İdeal olarak, protein kompleksleri saflaştırma veya çekme aşağı gerek kalmadan, doğal hallerine tespit edilebilir. Mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE), sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) için daha az denatüre alternatif olarak geliştirilen ve biyolojik örnekler 7 bazı proteinler ve komplekslerin ayrılması için izin veriliyordu. Bununla birlikte, BN-PAGE'de proteinler lar göre ayırmakdiğer moleküllerle boyut, yük ve üç boyutlu yapı ve birlikte dahil olmak üzere değişkenlerin ge sayısı. Bu faktörlerin etkileşimler genellikle proteinlerin eş ayrılması, agregat oluşumu ve kötü protein bandı çözünürlüğü ile sonuçlanır. İki boyutlu yerli-poliakrilamid jel elektroforezi bu sorunların 8, hepsi bir giderir, ama.
Doğal ayrılması ile ortaya çıkan komplikasyonları aşmak için, bazı yazarlar, doku lysate'lerin 4 protein kompleksleri yakalamak için bu ditiyobis (süksinimidil propionat) gibi amin-reaktif çapraz bağlama reaktifleri, (DSP) kullanır. Bu muamele edilmiş Lizatlar daha sonra denatüre edilmiş ve protein kompleksleri doğal boyutu ve makyaj korurken, SDS-PAGE ile ayrılabilir. çapraz bağlama reaktifleri, doku lizatlarında başka bir molekülün yakınlığı ve proteinlere dayalı tepki Bununla birlikte, çok serbestlik derecelerine sahip ve stokastik, spesifik olmayan arka plan çapraz etkileşim-linking özellikle konsantre örneklerinde, yüksek olabilir. Bu zor-yorumlama sonuçlara yol açabilir.
Burada, bir hibrid BN-PAGE / SDS-PAGE yöntemiyle kullanımını gösteren, ayrı ve kompleks karışımlar protein derlemeleri tespit etmek için, multimeri-poliakrilamid jel elektroforezi (multimer-PAGE) olarak adlandırılır. Başlangıçta, hücre lizatı, BN-PAGE ile poliakrilamid jel içinde süspansiyon haline getirilir. lizat içeren Jel daha sonra çapraz bağlama reaktifi DSP ile reaksiyona sokulur. Sözde hareketsiz ve biraz jeli üzerinde ayrıldı, proteinler arka çapraz bağlayıcı tepkime azalır, yani daha az spesifik olmayan bir tepki muhtemeldir. Çapraz bağlanma sonrası, jel, bantlar kesilir ve SDS-PAGE ile ayrılmıştır. Elde edilen jel daha sonra, tipik olarak poliakrilamid jel elektroforezi ile ilişkili herhangi bir yolla analiz edilebilir. Bu yöntem, ilave saflaştırma veya çekme Dow gerek kalmadan, modifiye edilmemiş doku lizatındaki doğal protein komplekslerinin ayrıştırılması ve algılanması amacıyla sağlarn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protein-protein etkileşimleri canlılar yürütmek her görev için önemlidir. Bu nedenle, bunlar yoğun inceleme ve araştırma konusudur. Multimer-PAGE yakalama ayrılması ve protein kompleksleri çok çeşitli analiz etmek için bir yeni yöntemdir. Daha önce hastalıkla bağlantılı protein α-sinüklein 11 oligimerization okuyan uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Şekil 2'de gösterildiği gibi Bununla birlikte, pek çok protein kompleksleri için uzatılabilir…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH / NİDA DA034783 tarafından desteklenir. Biz multimeir-PAGE ile teknik yardım için Bryan A. Killinger teşekkür ederim.
Materials
| Chemicals | |||
| ε-Aminocaproic acid | Sigma | A2504 | |
| Acrylamide | Acros Organics | 164855000 | Toxic. |
| Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution) | BioRad | 161-0148 | Toxic. |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| Anti rabbit IgG-HRP from goat | Santa Cruz Biotechnology | sc-2004 | |
| Bicinchoninic acid assay kit | Thermofisher | 23225 | |
| Bis-tris | Sigma | B9754 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9647 | |
| Butanol | Fisher Scientific | A399-1 | |
| Chemiluminescence substrate kit | ThermoFisher | 24078 | |
| Coomassie blue G-250 | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Digitonin | Sigma | D141 | Toxic. |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher Scientific | D128-1 | |
| Dithiobis(succinimidylpropionate) | Thermo Scientific | 22585 | |
| Dry nonfat milk | LabScientific | M0841 | |
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | Thermofisher | 78430 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144SI-212 | For titration. Caustic. |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | For PVDF membrane activation. Toxic. |
| Monoclonal anti α-synuclein IgG from rabbit | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
| N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| N,N'-methylenebisacrylamide | Acros Organics | 16479 | Toxic. |
| NP40 | Boston Bioproducts | P-872 | |
| Polysorbate 20 (tween-20) | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Polyvinylidene fluoride transfer membranes | Thermo Scientific | 88518 | |
| Ponceau S | Sigma | P3504 | |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217-3 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific | 88265 | |
| SDS solution (10% w/v) | BioRad | 161-0416 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | L37771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8) | BioRad | 161-0799 | |
| Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8) | BioRad | 161-0798 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| GE Imagequant LAS 4000 | GE Healthcare | 28-9558-10 | |
| ImageJ software | NIH | ||
| Synergy H1 microplate reader | BioTek | ||
| Gel Former + Stand | Biorad | ||
| Microfuge 22R centrifuge | Beckman Coulter | ||
| 2 mL dounce homogenizer | |||
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Ultrasonic tissue homogenizer | Fisher Scientific | FB120220 |
References
- Alberts, B. The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists. Cell. 92 (3), 291-294 (1998).
- Pawson, T., Nash, P. Protein-protein interactions define specificity in signal transduction. Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).
- Rual, J. F., et al. Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network. Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).
- Ho, Y., et al. Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).
- Krogan, N. J., et al. Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Beisiegel, U. Protein Blotting. Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).
- Killinger, B. A., Moszczynska, A. Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis. Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).
- Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein. PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).
- Wong, S. S. . Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Tanford, C., Reynolds, J. A. Characterization of membrane proteins in detergent solutions. Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).
- Peters, K., Richards, F. M. Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure. Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).
- Lomant, A. J., Fairbanks, G. Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate). J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).
- Sun, F., et al. Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II. Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
