קביעת העוצמה היחסית של Anti-TNF חד-שבטיים נוגדן (mAb) על ידי Neutralizing TNF באמצעות שיטת וביו-אנליטיות וואלידציה , חוץ גופית
Summary
פרוטוקול מצפני פעילות נגד יחסית-מוות mAb אנטי-TNFα באמצעות מנגנון ניטרול עם תאי ה-וואי 164 מוצג כאן. פרוטוקול זה שימושי השוואת כוח ניטרול של מולקולות שונות אותה פונקציונליות ביולוגי.
Abstract
פרוטוקול זה מראה את המדידה של הניטרול פעילות מוות של TNFα במודל של עכברים פיברובלסט תא (ה-וואי 164) באמצעות mAb אנטי-TNFα. בנוסף, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את מולקולות אנטי-TNFα אחרות, כגון חלבונים פיוז’ן. המודל הסלולר המועסקים כאן הוא רגיש אפופטוזיס בתיווך TNFα כאשר גורם מתח נוסף הוא המושרה תא תרבות בתנאים (למשל, מניעת סרום). פרוצדורה זו מדגימה את אופן ביצוע וזמינותו אנליטית זו, המדגיש את פעולות המפתח הנוגעות הכנת הדוגמא תא דילול, אפופטוזיס, מדידות spectrophotometric כי הם קריטיים כדי להבטיח תוצאות מוצלחות. פרוטוקול זה חושף את התנאים הטובים ביצועים הנוגעים אפופטוזיס ושידור יעיל הקלטה, מובילים לערכים אי הוודאות נמוכה.
Introduction
עוצמת הביולוגי היא מדד כמותי של פעילות ביולוגית המבוססת על התכונות המוצר לבדיקה המקושרות הביולוגי במאפיינים הרלוונטיים, ואילו כמות (המתבטא בנפח גדול) הוא מדד physicochemical של תכולת החלבון. בדיקות מינון, יחד עם שיטות אנליטיות אחרות, מבוצעות כחלק המוצר עמידה ויציבות מחקרים comparability. במובן זה, העוצמה מדידות משמשים כדי להדגים כי המוצר אצוות לפגוש את תכונות איכות קריטיים (CQAs) או קריטריוני קבלה במהלך כל שלבי של ניסויים קליניים, לאחר אישור שוק.
אפופטוזיס הוא מוות תאים מתוכנת, באופן טבעי כאשר תאים נגועים בווירוס, או כאשר התאים לחוצים על ידי סביבתית גורם זה פשרות הסלולר הכדאיות ותפקוד1,2. בין היתר, אפופטוזיס עיכוב או נטרול הביולוגי, הוא אחד ממנגנוני טיפולית הידוע בעיקר mAbs, במיוחד בטיפול במחלות כרוניות, כגון הפרעות דלקתיות בתיווך החיסון. מולקולות אנטי-TNFα להפעיל תכונות טיפוליות שלהם על ידי חסימת האינטראקציה של הגידול נקרוזה מקדם אלפא (TNFα) עם p55 ו p75 התא קולטנים משטח3, ובכך למנוע מסלולים אות לבסוף להוביל אפופטוזיס הסלולר.
TNFα יכול לייצר דלקת כמה מחלות כרוניות4. TNFα מופרש spuriously לתוך חצרו חוץ-תאית על ידי מקרופאגים, אשר זקיפים של מערכת החיסון המולדת והשחקנים העיקרי בסוג זה של המחלה5. כנתיב נפוצות, ורשות TNFα משויכת בפתוגנזה של מחלות אלה. ללא שליטה, תחת אינדוקציה קבוע ומתח תא, TNFα גורם ניוון המוות ואת הרקמה תא, בסופו של דבר שמוביל דלקת מפרקים שגרונית, קרוהן ו- פרופילים פתולוגיים אחרים6.
היריבים TNF לחסום את האינטראקציה בין TNF רצפטורים שלו היו בשימוש יותר ויותר כדי להפחית התנסותו לעכב את התקדמות המחלות האלה כמו טיפול יעיל. כיום, אנטי-TNFα סמים המוצרים נמצאים בשימוש נרחב כדי לשלוט הריכוז מערכתית של ציטוקין, עוד יותר ובכך למנוע ניוון של רקמות מעורב. במובן זה, מתן של bioassay חזקים הדירים לתאר את יכולת ספציפית של תרופה כדי להשיג את האפקט הביולוגי שלו הכרחי.
ב פרוטוקול זה, קריטי צעדים-שזוהו במהלך התפתחות וזמינותו ניטרול-לשקילת מוצלחת העוצמה ביולוגי מודגשים, עם דגש על הכישורים הדרושים כדי לבצע את פעולת השירות ביו-אנליטית. שיטה זו ביו-אנליטי מספקת מידע שימושי comparability בין קבוצות שונות או אנטי-TNFα מוצרי התרופה לעומת חומר עזר קליניות.
Protocol
Representative Results
Discussion
אפיון זה מסייע לקבוע א-פריורי התנהגות ביולוגית של מולקולה בפיתוח לפני נערכים ניסויים קליניים יקרים ולגזול. זה שימושי גם לשחרור אצווה-כדי-אצווה של מוצר סמים שאושרו. ראוי להזכיר כי אלה מבחני שימושיות לקביעה אם מולקולה יש השפעה ביולוגית נאותה לגבי מנגנון הפעולה שלה. שיטת ביו-אנליטי המוצ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית של המדע ולהעניק טכנולוגיה (CONACYT), מקסיקו פיי CONACYT 2015 220333, ללא השתתפות בעיצוב של המחקר.
Materials
| WEHI 164 | ATCC | CRL-1751 | Fibrosarcoma cells from Mus musculus |
| RPMI-1640 Medium | ATCC | 30-2001 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| RPMI 1640 Medium, no phenol red | GIBCO | 11835-030 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Trypsin-EDTA(0.25%),phenol red | GIBCO | 25200-056 | Store medium at -10 °C to -20 °C |
| DPBS, no calcium, no magnesium | GIBCO | 14190-136 | Store medium at 2 °C to 8 °C |
| Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | Store at -20 °C to -70 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S), Super Low IgG | HyClone | SH3089803 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized | HyClone | SH3007103 | Store at -10 °C to -20 °C |
| Caspase-Glo 3/7 Assay kit | Promega | G8093 | Store the Caspase-Glo. 3/7 Substrate and Caspase-Glo. 3/7 Buffer at –20 ºC protected fromLight |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate, Crystal, A.C.S. Reagent | J.T.Baker | 8993-01 | — |
| Sample mAb Adalimumab | Probiomed | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Reference and Control mAb Adalimumab | Abbvie | NA | Final concentrations in the microplate are: 0.666, 0.333, 0.167, 0.111, 0.083, 0.056, 0.042, 0.028, 0.014 and 0.004 μg/mL |
| Microplate Reader | Molecular Devices | 89429-536 | SpectraMax M3 Multi-Mode |
| Microplate reader Software | Molecular Devices | — | SoftMax Pro 6.3 GxP |
| Incubator | Revco | 30482 | Revco RNW3000TABB Forced-Air CO2 |
| Laminar Flow Hood | The Baker Company | 200256 | Baker SG603A-HE | High Efficiency, Class II Type A2 |
References
- Elmore, S. Apoptosis: A Review of programmed cell death. Toxicol Patho. 35 (4), 495-516 (2007).
- Darwish, R. S. Regulatory mechanisms of apoptosis in regularly dividing cells. Cell Health Cytoskelet. 2 (1), 59-68 (2010).
- Tracey, D., et al. Tumor necrosis factor antagonist mechanism of action: A comprehensive review. Pharmacol Ther. 117 (2), 244-279 (2008).
- Körner, H., Sedgwick, J. Tumour necrosis factor and lymphotoxin: Molecular aspects and role in tissue-specific autoimmunity. Immunol Cell Biol. 74 (5), 465-472 (1996).
- Wong, M., et al. TNFa blockade in human diseases: Mechanisms and future directions. Clin Immunol. 126 (2), 121-136 (2008).
- Furst, D. E., Wallis, R., Broder, M., Beenhouwer, D. O. Tumor necrosis factor antagonists: different kinetics and/or mechanisms of action may explain differences in the risk for developing granulomatous infection. Semin Arthritis Rheum. 36 (3), 159-167 (2006).
- Karvinen, J., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence quenching assay (LANCE) for caspase-3. J Biomol Screen. 7 (3), 223-231 (2002).
- Ren, Y. G., et al. Differential regulation of the TRAIL death receptors DR4 and DR5 by the signal recognition particle. Mol Biol Cell. 15 (11), 5064-5074 (2004).
- Sud, D., Bigbee, C., Flynn, J. L., Kirschner, D. E. Contribution of CD8+ T cells to control of Mycobacterium tuberculosis infection. J Immunol. 176 (7), 4296-4314 (2006).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Apendix 3, 3 (2001).
- Ramasubramanyan, N., et al. . Low acidic species compositions and methods for producing and using the same. 1, (2014).
- Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2 (9), 2276-2284 (2007).
- Eskandari, M. K., Nguyen, D. T., Kunkel, S. L., Remick, D. G. WEHI 164 subclone 13 assay for TNF: sensitivity, specificity, and reliability. Immunol Invest. 19 (1), 69-79 (1990).
- Hora, M. S., Rana, R. K., Smith, F. W. Lyophilized formulations of recombinant tumor necrosis factor. Pharm Res. 9 (1), 33-36 (1992).
- Ponnappan, S., Ponnappan, U. Aging and immune function: molecular mechanisms to interventions. Antiox Redox Signal. 14 (8), 1551-1585 (2011).
- Matsumaru, K., Ji, C., Kaplowitz, N. Mechanisms for sensitization to TNF-induced apoptosis by acute glutathione depletion in murine hepatocytes. Hepatology. 37 (6), 1425-1434 (2003).
- Camacho-Villegas, T., Mata-Gonzalez, T., Paniagua-Solis, J., Sanchez, E., Licea, A. Human TNF cytokine neutralization with a vNAR from Heterodontus francisci shark: a potential therapeutic use. mAbs. 5 (1), 80-85 (2013).
- Männel, D. N., Falk, W. Optimal induction of tumor necrosis factor production in human monocytes requires complete S-form lipopolysaccharide. Infect Immun. 57 (7), 1953-1958 (1989).
- Lis, K., Kuzawińska, O., Bałkowiec-Iskra, E. Tumor necrosis factor inhibitors-state of knowledge. Arch Med Sci. 10 (6), 1175-1185 (2014).
